肝实质由大量肝细胞和少量间质组成,人胎儿、成人和动物的肝脏皆可用于培养;
肝脏具有取材方便和易于生长的优点,能获得典型上皮细胞培养。肝细胞形态规整,有多
种功能并具有代谢活化致癌物的能力,适用做多种研究;我国已建有多个人肝癌细胞系。
一、初代组织块培养
肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀
或剪刀把肝剪成1 mm
3
左右的小块,采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁,生长力好,一般
次日即可出现生长晕。
二、初代消化法培养
1. 把肝组织切成2~4 立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS液洗两次。
2. 移入1:1 的0.1 %胰蛋白酶和0.1 %胶原酶(都用无钙镁BSS配制)中,4 ℃冷消化 10~12 小时后,通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过 亦可)。
3. 收集细胞、BSS液洗1~2 次、计数、接种培养。
消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法:肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和 大鼠为好。
1. 无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS洗除血污。
2. 取5 ml注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结 扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入胆管系统,并不时轻柔压肝脏, 以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20~30 分后,在吸出消化液的 同时并轻柔压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出。
3. 待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI1640培养基培养(较 其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。
三、传代培养
待细胞生长连接成片后,用BSS洗一二次,加1:1的0.025 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA
混合消化3~5 分钟,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液、用BSS洗一二次,注入营
养液、吹打、制成细胞悬液、再接种培养。