一、材料
无菌
1. 解剖器械
2. 含有或不含有血清的培养液(如 M199)
3. 非组织培养处理的滤膜培养皿(如 Costar Transwell 聚碳酸酯,#3423,Corning)
4. 12 孔的培养板(Corning)
非灭菌
1. 已受精的鸡蛋,孵育 8 d
二、操作步骤
1. 将滤膜培养皿放在多孔培养板的各个孔内,加入培养液直至达到滤膜底面水平(约 1 ml)。
2. 将多孔培养板放入湿润的 37°C 恒温 CO
2
培养箱中,以调整培养液的 pH。
3. 准备组织或切出整个胚胎器官(如 8 d 鸡胚的股骨或胫骨;见方案 12.2 和方案 12.7)。在一个纬度,组织厚度必须不超过 1 mm,最好更小(如 8 d 胚的胫骨长度可能达 5 mm,但直径仅 0.5~0.8 mm。皮肤小块可为 10 mm
2
,但厚度仅为 200 μm。必须切成小块的组织不应大于 1 mm
3
,如肝或肾)。
4. 在短时间内解剖标本(< 1 h),HBSS 要充足。但是,较长时间解剖时应在以 HEPES 缓冲为 pH7.4 的 HBSS 中添加 50% 血清。
5. 从培养箱中取出多孔板,小心地将组织转移到滤膜上。这一步最好用 Pasteur 吸管完成,可同时吸出随组织块转移出的液体,应小心不要刺破滤膜。在吸取前,先用培养液湿润吸管内壁,以防止吸取时组织块黏到吸管壁上。
6. 检查培养液的水平,确认将组织浸湿,但没有完全浸没。然后,将培养板放回培养箱中。
7. 2~4 h 后再次检查,确保培养液面保持在滤膜和组织块之上,但深度不足以使组织块浮起。
8. 将组织培养 1~3 周,根据样本需要,每隔 2~3 d 更换培养液 1 次。