做透射电镜观察需进行切片、固定和包埋细胞过程,与一般组织切片法大体相似,其最大的难题是如何把细胞完整无损地从培养瓶皿壁上包埋下来。自从定型产品塑料薄膜问世后,这一困难已被克服。应用无菌塑料薄膜是极其理想的支持物,比用盖玻片、微孔滤纸、云母和卵壳膜等支持物都好。把细胞直接培养在塑料薄膜上,不仅细胞生长效果好并可与细胞一起包埋切片,免除了很多麻烦。若利用其它材料不仅不利细胞生长,最大缺欠是在包埋前需把细胞从支持物上分离下来,增加了工作量。
一、透射观察法
透射观察必须切片,根据培养细胞种类和培养方法不同分原位切片
和消化分离切片两种。1. 在用玻璃瓶培养细胞做透射观察时,做原位切片非常复杂。只能采用消化法把细胞 制成悬液才能进行包埋和切片。其过程为:消化分离细胞、固定、包埋、切片和观察几 项。
进行消化时,应注意,消化液的浓度不宜太大、消化时间也要适度,吹打细胞动作 要轻微,以防损害细胞表面的微细结构。然后低速离心,令细胞沉于离心管底部(用锥 形离心管最好),吸除上清液,立即加戊二醛固定。其余包埋、切片等步骤与一般组织 相同,请参阅其它电镜技术,此不赘述。
2. 单层培养细胞通过消化分离细胞包埋法的优点是获细胞数量多,便于进行包埋和切片。
缺点一是通过消化可能损伤细胞表面结构,二是消化改变了细胞单层生长时细胞相 互接壤关系。
3. 也可采用原位包埋法,为此应把细胞培养在无菌聚苯乙烯塑料薄膜上,便 于进行固定、包埋、切片处理。
聚苯乙烯薄膜是一种由聚苯乙烯制成的厚度类似盖片、 无毒、质地柔软、已消毒包装的成品(国内尚未见生产)。用时可剪切成适宜的小块置入 瓶中,然后再向瓶中接种细胞,待细胞附于盖片上并生长后,取出、进行固定、剪切成 小块、直接包埋入Epon胶囊中,很易切片,是原位包埋透射电镜观察细胞理想的方法。
如观察的为悬浮细胞,因悬浮细胞不必做消化处理,可直接进行离心、固定、包埋 和切片,细胞保存效果好。
二、扫描观察
培养细胞扫描观察非常方便,在观察贴壁细胞时也需进行消化,制备 成细胞悬液后,用Hanks液漂洗1~2 次,除去细胞碎块和血清蛋白等(以免妨碍观察)。 其余处理与血细胞扫描电镜观察法相同。
进行原位扫描观察培养细胞更为容易,可按以下步骤进行:
1. 加支持物小盖片培养法培养细胞,至指数增生期;
2. PBS pH7.4漂洗两次,以去除培养液;
3. 25 %戊二醛/PBS固定30 分钟;
4. PBS漂洗3 次;
5. 1 %OsO 4 固定45 分钟;
6. PBS漂洗3 次;
7. 脱水
丙酮/醋酸异戊酯(1:1)10 分钟→醋酸异戊酯30 分钟;
8. 临界点干燥;
9. 喷金;
10. 扫描电镜观察(Hitachs-450)、照像。