1. 在无菌条件下,取出理想的前列腺叶,放入灭菌过的 60 mm Petri 培养皿(玻璃或塑料的,直径为 60 mm)。
2. 剪除前列腺叶的脂肪,然后称重。
3. 加入 2 ml 胶原蛋白酶(675 U/ml,用含有 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 卡那霉素的 MSS 配制)。
4. 用手术剪将前列腺叶剪成约 1 mm 大小的组织块。组织块应小,足够通过 14-G 插管。
5. 用注射器和 14-G 插管将组织块移于灭菌过的 25 ml Erlenmeyer 烧瓶,然后加入胶原蛋白酶,每 0.1 g 湿组织加入1 ml。
6. 置于振荡水浴箱,在 37°C 条件下孵育 1 h 。
7. 分 3 次用 14-G 插管吸出消化的细胞悬液,然后用孔径为 1 mm 的金属丝滤网(孔径为1 mm,与 50 ml锥形离心管配用)将细胞悬液滤入 50 ml 圆锥形塑料离心管,以除去碎片和未消化的组织。加入等量含有 5 % 胎牛血清或马血清的 MSS,浸洗细胞悬液。
8. 在 4°C 条件下离心(100 g,5 min),收集细胞。
9. 用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 混悬细胞,然后依次用孔径为 250 μm 、150 μm、100 μm 和 40 μm的尼龙滤网(与 50 ml 锥形离心管配用)过滤细胞悬液,并每次用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 冲洗滤网。
10. 通过离心收集细胞,然后用 5 ml WAJC404 培养液混悬细胞。
11. 计数细胞,将细胞浓度调整至 4×10 6 个/ml。
12. 将细胞接种于 24 孔板,每孔(面积约为 2 cm 2 )接种 50 μl 细胞悬液(含有 2×10 5 个细胞)。每孔内有 1 ml WAJC404 培养液、10 ng/ml 霍乱毒素、1 μmol/L 地塞米松、10 ng/ml EGF、1μg/ml 催乳激素、5 μg/ml 胰岛素、10 ng/ml 前列腺调理素、100 U/m 青霉素和 100 μg/ml 链霉素。可按McKeehan 等 [1984] 以及 Chaproniere 和 McKeehan [1986] 叙述的方法替代部分精制的前列腺调理素。
13. 在 95 % 空气和 5 % CO 2 的湿润环境和 37°C 条件下培养。第 3 天和第 5 天换液。第 7 天细胞可能接近单层。