目前长时间保存细胞的方法是将细胞低温冻结保存在液氮中（－196 ℃），保存时间可长达一年甚至几年，用时解冻，大多数细胞仍能生长繁殖，为妥善起见，细胞冻存一年后应复苏培养后再冻存。冻存细胞时应加入保护剂，否则，细胞内外的水会结成冰晶，使细胞发生机械损伤。加入保护剂后，可使冰点降低，在缓慢冻结的条件下，细胞内的水分在冻结前渗出到细胞外，避免冰晶的损伤。目前常用的保护剂为甘油和二甲基亚砜（DMSO），它们对细胞无毒，分子量小溶解度大，易穿透细胞，使用浓度甘油为10％～20％，二甲基亚砜5％～15％，常用为10％。另外，冻存液中还要加入培养液，以提供营养，渗透压，pH。细胞复苏指融化冻存的细胞，重新培养。解冻细胞速度要快，使之迅速通过最易损伤的－5～0 ℃。
一、细胞冻存
1. 细胞悬液制备
选对数生长期细胞，10 ml 培养瓶面，几乎成单层时可冻存一管；收集细
胞24 小时前换液一次；按传代方法制成细胞悬液。
2. 收集细胞
将细胞悬液移入无菌离心管中，1000 rpm，离心5 分钟，去上清。
3. 冻存液
将培养液和甘油按9：1 的比例配成10％的冻存液，取1～1.5 ml 到离心
管中，轻轻吹打使细胞悬混。
4. 装瓶
用吸管吸取细胞悬液1.5 ml，装入安瓶中，尽量不使液体碰到安瓶口。
5. 封口
将安瓶在火焰最热处封好，如用冻存管将盖儿拧紧即可。
6. 标记
用记号笔记好细胞名称，冻存年月日。
7. 冻结和保存
将安瓶装在纱布袋中，置4 ℃ 2～4 小时，－20 ℃ 2～4 小时，液氮的气
相部分－130 ℃～－180 ℃，浸入液氮。液氮量一定要充分，以使温度恒
定。
二、细胞复苏
1. 用大镊子取出液氮中的安瓶，投入盛有37～42 ℃的水中，不时摇动，使
之快速通过－5～0 ℃。
2. 在超净台中，用砂轮擦安瓶颈并用酒精棉球消毒，打开安瓶，吸出细胞
悬液装入培养瓶中，并以10×稀释，放CO
2
培养箱中进行培养，第二天换
新鲜培养液，以换掉冻存剂。