含有目的基因真核表达 pEGFP-C1载体的构建实验-转化

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl 2 )处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant),即带有异源DNA分子的受体细胞)。
1.  100 ul感受态细胞在冰中融化。
2.  分装2管,50 ul/管。
3.  加入转化的DNA Xul。
4.  冰中放置30 min。
5.  42 ℃放置90 sec。
6.  冰中放置2~3 min。
7.  加入4倍体积的SOC液体培养基或LB液体培养基。
8.  37 ℃振荡培养1 hrs。
9.  涂平板,37 ℃温箱培养12~16 hrs。
注意事项

1.  加入DNA的量要小于10 ng,DNA的量过高影响转化效率。

2.  SOC培养基可以用LB培养基替代,但是转化率低于使用SOC培养基。
3.  热激温度42 ℃一定要准确,否则影响转化效率。

2014-12-12