标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab′)2，一个Fab片段与标本中的抗原结合，一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后，再加入铁蛋白与抗体结合，从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后，直接电镜观察。
一、材料及试剂
1. 待检病毒材料 如粪便，气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。
2. 高速离心机
3. 已知抗体
4. 磷钨酸
5. 琼脂糖
6. 其它
二、操作方法
1. 制备免疫复合物。
2. 以生理盐水或pH7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖，趁热浇注于洁净的载玻片上，每片3ml，待冷却凝固后，在凝胶面上等距离放置直径4 mm玻璃珠数粒，再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2 ml～3 ml，冷却凝固后，取出玻璃珠，使凝胶形成凹孔。
3. 将普通滤纸剪成2×3 cm大小，3～4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔，平放在滤纸上。
4. 在凹孔内，加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。
5. 将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用，20 min～30 min后，可将液滴的水分吸干，而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。
6. 在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20 s，过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。
7. 于透射电镜4×10
4
倍下观察。
三、结果判定
直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入，大大提高了观察的敏感性。
2014-12-12