多克隆抗体提取实验-Tris-PO4 离子交换层析法

一、材料和试剂

1.  DE32或DE52纤维素。
2. 待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
3. 1.5×50 cm 层析柱;透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
4. 梯度洗脱液包括:0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO 4 ;0.055 mol/L,pH6.0 Tris-PO 4 ;0.5 mol/L,pH5.1 Tris-PO 4
二、操作步骤
1. 蛋白标本对0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4 透析。
2. DE52装柱,并以0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4 平衡。
3. 加样,以0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4 洗脱,紫外监测直至洗脱液280 nm OD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。
4. 以350 ml 0.055 mol/L,pH6.0 Tris-PO4 洗脱,这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。
5. 以125 ml 0.055 mol/L,pH6.0 Tris-PO4 和125 ml 0.5 mol/L,pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脱,总量收集250 ml;重复步骤(5)。
6. 根据280 nm峰值合并蛋白峰,透析浓缩和保存同上。
用过的DE52可用0.01 mol/L,pH8.6 Tris-Cl和0.5 mol/L NaCl、0.01 mol/L,pH8.6 Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性,加入0.02%叠氮钠于4℃保存备用。

2014-12-12