1.  当进行双标记实验时，最重要的准则是：第一抗体应为不同类型，从而使第二抗体能分别识别之。第一抗体最好是来源于不同免疫动物。但如使用单克隆抗体，这一要求就有可能达不到，当使用单抗时，不同型的抗体如IgG和IgM，可被第二抗体确切区分。但不同亚类（IgG 1和IgG 2）的抗体通常不能被二抗确切区分。

2.  实验操作过程和“”相同，例外的是所加第一抗体和第二抗体由两种第一抗体及两种第二抗体的混合成分所替换。