TNF-α受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据TNF-α与相应靶细胞结
合后引起不同的生物学效应，建立了多种检测TNF-α生物学活性方法。某些肿瘤细
胞膜表面的TNF-α受体与TNF-α结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测
对肿瘤细胞的杀伤能力，来反映TNF-α的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用
3
HTdR
标记，则被杀伤后
3
H-TdR释放至细胞外，通过测定肿瘤细胞释放
3
H-TdR
的量来反映TNF-α的杀伤活性。
1. 0.25 ％胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929细胞
9. 加入3 ％胰蛋白酶和0.25 ％DNA酶各10 μl/孔， 37 ℃，30 min
10. 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于 "9999"型玻璃纤维滤纸上
12. 结果判定
（1）TNF-α作用24 h后，在倒置显微镜下判定50 ％L929细胞杀伤的稀释度即为1 个TNF-α活性单位。
（2）根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位
2. 用RPMI1640洗涤细胞后，调整细胞浓度至2×10
6
/ml
3. 加入
3
H-TdR，20 μci/ml
4. 置37 ℃，5 ％CO
2
培养箱中2～3 h，摇动1 次/30 min
5. 用RPMI1640洗涤2次，800 rpm×5 min/次
6. 调整细胞浓度至2～3×10
5
/ml后，加入96孔
培养板中，100 μl/孔
7. 加入不同稀释度的待测样本（设三个重复孔）
8. 加入放线菌素D，使放线菌素D最终浓度至1 μg/ml，
用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准 品阳性对照， 37 ℃，5 ％CO 2 培养中24 h9. 加入3 ％胰蛋白酶和0.25 ％DNA酶各10 μl/孔， 37 ℃，30 min
10. 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于 "9999"型玻璃纤维滤纸上
11. 烤干后，进行β计数
12. 结果判定
（1）TNF-α作用24 h后，在倒置显微镜下判定50 ％L929细胞杀伤的稀释度即为1 个TNF-α活性单位。
（2）根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位
放线菌素D对照组cpm-实验组cpm
TNF-α活性单位（U/ml） ＝──────────×标准品活性单位×待测样品稀 释倍数
TNF-α活性单位（U/ml） ＝──────────×标准品活性单位×待测样品稀 释倍数
放线菌素D对照组cpm-标准品cpm
注意事项
1. 用于标记
3
H-TdR的L929细胞要处于对数生长期，否则
3
H-TdR掺入率低，
影响实验结果。
2. 标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的 3 H-TdR，则会影响完全 培基对照组cpm值。
3. 胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，酶均要摸索最适浓度 和时间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过 大，一般最终浓度为0.5～1 μg/ml。
5. 在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β（淋巴毒 素）的影响。因为TNF-β细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与TNF-α相似。
2. 标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的 3 H-TdR，则会影响完全 培基对照组cpm值。
3. 胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，酶均要摸索最适浓度 和时间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过 大，一般最终浓度为0.5～1 μg/ml。
5. 在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β（淋巴毒 素）的影响。因为TNF-β细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与TNF-α相似。
2014-12-12