废寝忘餐、呕心沥血、历尽艰辛，终于拿到一张漂亮的Western Blot图，这时却发现不知道如何计算灰度值，肿么办？Don’t worry!翠花今天就跟大家谈谈如何使用AlphaEaseFC 软件来处理Western Blot电泳图吧（下载软件请回复关键字：0614）。

首先，鼠标点击图标：

打开AlphaEaseFC 软件，然后在“File”中点击“open”，打开一张western blot的结果图，于是出现以下界面：

界面分为五个部分，横竖两个菜单条，三个窗口：图片、Tool Box和Contrast Adjustment。打开图片后，若需要裁剪图片的话点击“Edit”，选中“Edit Activition”，在图片中选取裁剪区域，鼠标点到白色正方形可以调整裁剪区域大小，再点击“Edit”，选中“Crop”,若想重新保存裁剪后的图片可以点击“File”，选中“Save modified”，若要覆盖原图片可以选“Save”。左边的菜条有一些快捷按钮：图片叠加、打开、保存、放大、缩小、饱和度调节等。

然后利用“Contrast Adjustant”中如灰度系数Gamma、线性 Linear 、使色彩均化Equal 等选项来调整条带与背景的最适合的灰度。以下是裁剪和灰度调整后的western 图。

如果图片本身不够完美，比如有噪点或者轮廓模糊，不用怕，我们可以帮它“化个妆”，点击“Enhancement Tools”，点击“Filters”，再选中“sharpen”和“Filter”就可以去噪点和使条带锐化，条带瞬间变得美美哒。

接下来在“Tool Box”中选中“Analysis Tools”,选中“Spot Denso”,界面会弹出“Spot Denso Results”窗口，Spot Denso Results中IDV一栏所示是目标条带的灰度值，注意“Black is 255,while is 0”，若显示为“Black is 0,while is 255”时则要在Tool Box中选中“Invert”逆转过来。在这里的“Object”有三种方式供选择来圈住条带，表示用椭圆形来圈条带，表示用长方形来圈条带，而表示按照鼠标移动的轨迹来圈住条带，三种方式各有利弊，手抖的童鞋慎用第三种。本文以第三种方式演示怎样圈条带获得灰度值。点击，在目标条带中沿着条带轮廓将条带圈起，鼠标点到白色正方形处可以调整所圈住的区域大小，接着在所圈的条带以外点击鼠标，目标条带左上方出现“1”，表示第一条条带，在“Spot Denso Results”中IDV一栏出现的数值就是该条带的灰度值。然后再点击，重复上述操作圈住第二条、第三条、第四条······条带。

待所有的目的条带都被我们圈起来以后，点击“OUTPUT”，选择保存的地方，则可将灰度值导出，以TXT的格式保存起来。

还有一种圈条带的方法，是针对轮廓比较清晰，与背景的对比度强烈的条带而使用的一种较为智能的方法：在“AUTO DETECT”中选择“AUTO SPOT”，在western图中选中要圈住的条带区域，然后回到“Tool Box”中点击“Find spot”，弹出一个对话框以后，很快便自动寻找到目标条带，如下图为绿色线条圈住的条带，接着点击“get data”，获得IDV值，点击“OUTPUT”，选择保存的地方，则可将灰度值导出。

最后将Txt里的灰度值转移到EXCEL中，求得各组中目的条带与内参条带的灰度值比值，再以对照组为分母，实验组为分子，获得实验组与对照组的灰度值比。

简单来说，用AlphaeaseFc 计算Western Blot电泳图灰度值分三步走：调灰度美化图片———圈条带获IDV值———EXCEL计算灰度值比值。

自从学会了AlphaEaseFC，导师再也不用担心我的western结果图不会处理了！！

作者：解螺旋.翠花 解螺旋出品

2015-07-22