一般使用RNAi做实验的常规步骤是：
- 1. 根据目的基因设计靶点序列，构建工具。
- 2. 工具验证有效性，通过qPCR检测mRNA量的改变。
- 3. 如果mRNA下降明显， 在目的细胞上进行功能试验。
- 4. 返回去对工具进行探索，做WB，是否脱靶等工作。
但是大家却经常绕过第二步和第三部，直接由第一步跳到第四步，即构建工具后就直接做WB检测。
这是不对的。因为RNAi的原理是：siRNA与DCIER等蛋白结合形成沉默复合物，结合到靶基因的mRNA，剪切该mRNA，从而敲减目的基因。（这里是knockdown，并不是knockout，所以不用silence）
所以评估RNAi是否work，我们不能检测蛋白，而需要去检测mRNA。
第二个需要注意的地方：我的蛋白表达怎么上升了？真是见了鬼了。
蛋白的检测并不是轻而易举的。不同蛋白的半衰期不同，mRNA降了，新蛋白少了。总蛋白能够看出差异，间隔时间是多少，你知道么？
mRNA降了，细胞反馈机制来弥补这个下降，是通过增加转录（mRNA增多），还是mRNA稳定性，还是翻译效率，还是蛋白稳定性，你知道么？
……
很多实验检测出来蛋白表达差异花掉了大半年甚至更多的时间，这并不是危言耸听。
细胞的反馈机制可能会触发蛋白翻译加快，蛋白稳定性增加。那么该怎么解决这个问题呢？
解决方案：
- 摸索收样时间（48-72h之间设置多个时间点进行摸索）
- 调整RNAi浓度（同样是摸索浓度）
- 考虑细胞的密度等因素。
2015-07-22