Real‐Time PCR数据分析纽普生物

相对于只能半定量的常规PCR而言，qPCR的优点是既可以用于判断序列的有无，即定性，也可以用于确定DNA拷贝数，即定量。而且qPCR的结果无需通过电泳，而是通过计算荧光值来评估。由此可见，数据分析在qPCR这项实验中的份量。

qPCR 的数据分析可以分成相对定量和绝对定量两种。比如处理组细胞与对照组细胞相比，X 基因的mRNA 改变了多少倍，这就是相对定量；在一定数目的细胞中，X 基因的mRNA 有多少个拷贝，这就是绝对定量。通常我们在实验室用得最多的就是相对定量的方法，本讲将详细解析相对定量的数据处理。

相对定量的分析结果是在相当量的实验组和对照组中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。这种分析方法是通过等量样本间比较得到结果，需要进行归一化处理以确保相比较的两组样本具有可比性。通常我们会选择使用在各个样品中表达保持不变的基因作为参照基因（内参），用内参的表达水平来进行归一化处理。

>>相对定量qPCR<<

何时选用相对定量qPCR？

如果对 RNA 模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，可以使用相对定量法。

常用的相对定量数据分析方法有：双标曲线法、ΔCt 法、2^‐ΔΔCt法(Livak法 )、用参照基因的ΔCt 法和 Pfaffl 法。

双标曲线法：每次实验都分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线，并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后使用如下公式得出目的基因表达差异。

双标曲线法不受扩增效率差异的干扰。但是对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线，而且必需有固定的标准品做标准曲线。

2^‐ΔCt=2^{‐（实验组 Ct‐对照组 Ct）}

2^‐ΔΔCt法：这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率都接近 100%，且相对偏差不超过 5%。计算公式如下：

首先用内参基因的 Ct 值对实验组(test)和对照组 (con)的靶基因 Ct 值进行归一化：

ΔCt test=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值

ΔCt con=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值

随后用对照组的Ct值归一实验组的ΔCt：

ΔΔCt=ΔCt test-ΔCt con

最后计算表达水平的差异倍数：

Change Fold=2^‐ΔΔCt

对照组表达=2^{(对照组内参 Ct‐对照组目的基因 Ct)}

实验组表达=2^{(实验组内参 Ct‐实验组目的基因 Ct)}

这种方法得到的对照组表达水平不是 1.0，但如果将得到的两个表达值都除以对照组表达值，则得到：

对照组 Ratio=1

实验组 Ratio

=2^{(实验组内参 Ct‐实验组目的基因 Ct)}/ 2^{(对照组内参 Ct‐对照组目的基因 Ct)}

=2^{‐[(实验组目的基因 Ct‐实验组内参基因 Ct)‐ (对照组目的基因 Ct‐对照组内参基因 Ct)]}

=2^‐(^Δ^{Ct test‐ ΔCt con)}

=2^‐ΔΔCt

得到的比值与2^‐ΔΔCt法是相同的，因此用参照基因的ΔCt 法是2^‐ΔΔCt的一种变化形式。

Pfaffl 法:当目的基因扩增效率(E target)和内参基因扩增效率(E ref)不同，但每个基因在实验组和对照组扩增效率相同时，可以按下列计算公式确定表达差异。

首先，与 2^‐ΔΔCt法的计算过程一样，先进行归一化校准：

ΔCt target=对照组目的基因 Ct‐实验组目的基因 Ct

ΔCt ref=对照组内参基因 Ct‐实验组内参基因 Ct

随后计算表达水平的差异倍数：

Change Fold= (E target) ^{ΔCt target}/(E ref) ^{ΔCt ref}

如果 E target= E ref=2，那么 Pfaffl 法就可以简化为：

Change Fold

=2^{ΔCt target}/2^{ΔCt ref}

=2^{ΔCt target‐ΔCt ref}

=2^{(对照组目的基因 Ct‐实验组目的基因 Ct)‐(对照组内参基因 Ct‐实验组内参基因 Ct)}

=2^{‐[(实验组目的基因 Ct‐实验组内参基因 Ct)‐ (对照组目的基因 Ct‐对照组内参基因 Ct)]}

=2^{‐( ΔCt test‐ ΔCt con)}

=2^‐ΔΔCt

因此，事实上，2^‐ΔΔCt法是 Pfaffl 法的简单特例。

那么，这些方法我们都必须一一掌握吗？ NO！只需要掌握最实用的双标曲线法和2^‐ΔΔCt法就足够应付所有情况了。

来源：解螺旋

2016-05-17