转自核酸科技

ChIP的一般流程：甲醛处理细胞---裂解细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入Protein A和Protein G，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---qPCR或者高通量测序分析。

经验分享：

1.交联固定

甲醛交联的作用是固定蛋白质与基因组DNA之间的相互作用。蛋白质和基因组DNA之间的相互作用有强有弱，有瞬时的相互作用也有长时间稳定的相互作用，因此针对蛋白质与基因组DNA之间相互作用较强的，可以缩短交联时间或者不交联（native ChIP）；而针对较弱的相互作用，则需要通过延长交联时间固定两者之间的瞬时相互作用。然而交联时间的长短对后续的超声有负面的影响，交联时间越长，后续片段超声打断越难。所以针对不同的实验，可以较宽范围的调节交联时间，一般控制在5到30分钟之间，一般以交联10分钟为主。

1.1悬浮细胞交联

悬浮细胞交联，即细胞处于悬浮状态，交联时将消化的单个细胞悬浮在交联缓冲液中，加入终浓度为1%的甲醛交联细胞10分钟，室温条件下在摇床中摇动使细胞充分交联。随后加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联，一般室温条件下反应5分钟即可。终止交联后用预冷的PBS清洗细胞两遍，吸去废液，将交联的细胞干冰或液氮速冻并置于-80℃，用于后续的实验。

1.2 贴壁细胞交联

贴壁细胞交联时要求贴壁的细胞密度不能太密，一般在80%左右即可。在培养皿中加入适量的交联缓冲液，加入终浓度为1%的甲醛室温条件下交联，交联后用终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联。用预冷的PBS洗去废液后，用细胞刮将细胞从培养皿中刮下来，保存于EP管中，干冰或液氮速冻，并置于-80℃，用于后续的实验。

1.3 组织细胞的交联

组织细胞的交联相对步骤要多一些，当组织细胞有血液时，用PBS清洗，除去血液。将组织浸在PBS中，用刀将组织快速的切成小块，小块的体积不大于0.5立方厘米。然后加入至少5倍体积的加入终浓度为1%的甲醛在室温条件下交联20分钟。随后用终浓度为0.125M甘氨酸终止交联。如果不接着往下做，终止交联后用预冷的PBS清洗细胞两遍，吸去废液，将交联的细胞干冰或液氮速冻并置于-80℃，用于后续的实验。接着往下做则需将组织在预冷的PBS中捣碎。捣碎时首先用松的杵接着用紧的杵捣碎组织。这个过程不需要加入蛋白酶抑制剂。捣碎组织后用100微米的细胞过滤器过滤到50毫升离心管中，用40毫升预冷的PBS清洗两遍后，将组织冻存，以备后续超声实验。

2016-05-25