小伙伴们，当我们看到国外实验室的英文paper中，很少有用Primer Premier5 设计引物，但看我们中文的paper，或是国内实验室发的SCI，很多人用到了Primer Premier5这个软件来设计引物，这是为嘛呢？机智师兄告诉你，Primer Premier5是个商业软件，在国外是要花钱买的，而且还贵，而国内呢，有一个东西叫做破解版！为了提高我们自己的知识版权意识，这里推荐给大家一个免费的，同样设计引物不错的软件——Primer3Plus，并用NCBI进行引物验证。

1. 进入Primer3Plus主页（http://www.primer3plus.com/）。Primer3Plus是一个网站，在这儿可以利用Primer3Plus结合设计荧光定量引物的要求来设计并验证引物。

2. 选择Run latest Version of Primer3Plus，就进入了设计引物的主页面，合理的使用<>，［］，｛｝符号使引物设计符合自己的要求，大家可以在具体实战中，深入体会这几个符号带来的方便。

3.避免多个重复碱基出现，避免4个或超过4个G出现在引物序列中。按照荧光定量引物要求设置参数。

产物长度：不应该超过400bp，最好100-150bp

GC％：30％-70%，最好45%－55%

引物长度：18-25bp，最好22-24bp

TM值：58-60oC，最好60 oC

3’端：3’端至少4个碱基保守，最好为T，C，G

点击General Settings一般设置，在Product Size Ranges里面按以上要求设置产物大小，引物长度，TM值和GC含量，其它默认参数不用更改。点击右上放绿色按钮

获得引物。

4. 我们获得了5对引物，并按照5’到3’的顺序，包含了引物和产物的一些基本参数。我们可以根据荧光定量引物要求，尽量选择G、C结尾的引物合成，如下图中红框所示，还可以在序列图中看到引物的位置。

5. 设计好引物后，我们要进行NCBI blast 引物验证，进入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

6. 点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项，在下面框中，按照5’－3’顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔20个以上n。

7. 选择物种数据库，如Human，Mouse或者Others（如果是非人和非小鼠物种）

8. 选择Somewhat similar sequences(blastn)

9. 点击Algorithm parameters, 在Expect threshold 输入1000，在Word Size 输入7。Word size不是字体大小的意思，应该理解为读长，按照7个一组核苷酸序列放到GeneBank中进行比对。 

10. 点击BLAST，开始比对，出现结果。颜色代表得分，选择引物的原则是：列表中大部分是目的基因，说明引物特异性高；但是可能物种不同，说明该基因在不同物种中保守。

用Primer3Plus＋NCBI设计验证引物是不是很简单，免费的软件也一样好用，保护知识产权，拒绝盗版，从我做起。

来源：解螺旋

2016-06-01