本文仅针对从来没有做过或者即将做过qPCR引物的小伙伴。

全文分两部分，第一部分就是简单粗暴的设计qPCR引物，到这一步，单纯需要qPCR引物的小伙伴可以去联系公司订购引物了，有耐心的小伙伴可以看下第二部分，松哥有大招留着，绝对是泡萝莉师妹、约冷艳师姐、钓鲜肉师弟的神器。

松哥一向高效率，按照老外的传统，咱开门见山，需要的准备工作如下：

• 一个目的基因

• 一台能上网的电脑

OK，开始，首先我先说明，本方法松哥采用的是primer3 在线设计软件，打开primer 3网站，请自行度娘，名称如下：

第一步：选择物种，我是做人类肿瘤的，所以自然选human。

第二步：你的目的基因序列黏贴进框框里

第三步：啥选项都不要动，直接点Pick Primer，引物就出来了！还贴心的告诉你扩增长度，引物的位置，一次给你4条，你就选2条去做，绝对没问题，并且引物是经过blast验证的，扩增长度合适，刚好做qPCR，是不是快如闪电？

好了，以上就是简单粗暴设计软件的内容，下面要讲的是如何做好qPCR。

“补充：还有一个建议是，你要qRT-PCR的基因如果很大众化，类似AKT、CCND1、KRAS、GAPDH等等，随便上pubmed上搜一个相关的研究报道，你就可以在文章的材料方法里面找到该基因qRT-PCR实验用的引物序列。艾玛，直接复制粘贴送去合成就可以了~

考虑大家习惯，还是写成一条条的便于记忆和浏览。

想做好qPCR，show出漂亮的结果，纠正不良的qPCR操作习惯，需要准备以下内容（以染料掺入法为例子）。

1. 设计目的基因引物。请参考以上内容，上海英俊默认是2OD，实际上2OD~5OD的价格是一样的，5OD做几千个样品是没问题的，我每次都是设计5OD，1OD/管，每次只溶解1管，其余4管冻存-80，理论上管用n年（每次松哥说到5OD，老板都会神秘的一笑）

2. 设计内参基因引物。这很重要，不同组织选择内参基因种类不同，常见内参有GAPDH、HPRT、ACTIN、UBC、UBB等等，不要人云亦云，自己去找文献看看目的组织内哪种内参最稳定，有钱的，需要数据可靠性高的，可以选择2种引物，更高大上的可以做3种及以上，然后利用qbase plus选择最稳定的引物（qbase plus请自行脑补充，松哥觉得完全没必要那么严格），这里绝对是装逼的地方，每次我说完这里，师姐师妹们的眼睛都是闪亮闪亮的，哦原来这样子。松哥是。。。善良的纯人，自然不会去想歪主意，请小伙伴们要把持住。

3. 准备一瓶灭菌超纯水用来稀释引物。虽然以前都说用TE缓冲液，但是qPCR还是用纯水的好，我当时比较款，用了ABI的超纯水，100ml打完折扣是100块钱，妈蛋，这TMD是水么，比五粮液还贵。英俊的引物说明很好（绝对不是做广告），加多少水到10umol都是告诉你的，请自觉寻找。

4. 在A工作区域内分装引物，加入灭菌水后，摇晃-10000rpm1分钟-分装40ul/管，我每次都是把上下游引物混在一起分装，这样比较方便，冻存后，每次用之前冰上溶解。

5. 在B工作区域内准备模版，cDNA 或者DNA，总之，1ugRNA，经逆转录合成cDNA 20ul体系的，我直接用纯水稀释到200ul。

6. 在C工作区域内加样，反应体系我反复摸索过了，96孔板内15ul反应体系既经济，反应又稳定，结果均一性比较好。

7.qPCR之前，先做一个普通PCR，跑电泳验证条带位置、引物扩征效率、同时产物测序以确定引物正确性，这一步很重要，注意别把PCR产物污染了工作区，一定要分区操作。所以跑普通电泳的地方要远离你qPCR加样区，否则，会死的很悲惨。旁边实验室的师弟因为产物污染实验室，项目被迫终止，去了别的学校做qPCR，所有样本、引物、PCR试剂全部丢弃。

8. qPCR加样结束后，离心，上机。PCR程序2步法虽然省时间，但是我还是喜欢三步法，即变性95，退火59，延伸72，40个循环，溶解曲线程序仪器一般自带。

9. 结束反应，导出结果入excel，利用2-△CTor 2-△△ct计算结果。

注意：qPCR产物一般不需要长，<200bp，也有人说<150bp，太长影响解链。老式的ABI 7300，7500需要加ROX校正每个样品设置3个复孔，出现一个不好的就把那个不好的给删掉，如果出现2个不好的呢？松哥的做法：删掉2个不好的。。。。粗暴吧。

来源：解螺旋

2016-06-17