你有没有用过XbaI或者ClaI酶？有没有遇到过比较奇葩的现象？你是否了解DpnI能消化模板DNA而不能消化掉新合成的DNA的原理？——以上都是因为相同的原因：DNA的甲基化。

为什么是甲基化？

限制性内切酶在实验室中随处可见，人们很容易忘记这些细菌来源的酶的真正功能。原核细胞为了保护自己，选择性地降解外源DNA，可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。限制内切酶负责降解进入原核细胞的外源DNA，甲基化酶则对细胞自身的DNA进行甲基化，从而保护细胞的DNA，使其不被自己细胞内的限制性核酸内切酶降解。

除了上述限制性修饰系统，DNA甲基化在调节基因组复制，错配修复和促进/抑制蛋白表达过程中发挥作用。参与这些过程的甲基化酶（如Dam和Dcm甲基化酶）与限制性修饰系统是独立的，但仍然可以影响某些限制性内切酶是否能有效地切开DNA。

常见的实验室K12的大肠杆菌菌株如DH5alpha包含3种甲基化酶识别不同的DNA甲序列：

Dam甲基化酶在DNA的GATC moti的A上添加一个甲基。

Dcm甲基化酶在DNA的CCWGG的第二个C上添加一个甲基。

EcoKI甲基化酶在DNA的AACNNNNNNGTGC或者GCACNNNNNNGTT motif的A上添加甲基。

甲基化酶对克隆和酶切的影响

尽管不是所有的原核DNA有着相同的甲基化水平，但是在酶切消化的时候还是要考虑甲基化的影响。尽管有些甲基化酶不属于限制性修饰系统，但是他们识别的序列和有些内切酶的识别位点重合，从而抑制了这些酶的酶切功能。

比如XbaI的识别序列是TCTAGA，如果在该序列前面有GA紧邻或者该序列后面有TC接着，那么Dam的甲基化作用会使得XbaI切不开该位点。相反地，DpnI酶切要发挥活性则需要DNA发生甲基化。DpnI酶在定点突变中是一个很常用的酶，它一般用于老的DNA模板的去除。而这些老的DNA模板需要从dam+的大肠杆菌中提取才行，这样提取的DNA质粒上的GATC序列会带上甲基化修饰，刚好可以被DpnI酶给消化掉。而通过PCR扩增出来的新的DNA模板则会被保留。

如何知道某种内切酶会被甲基化修饰影响？

下面列出了被甲基化修饰抑制的常见10种限制性内切酶

可以通过REBASE database查询更多的限制性内切酶的相关信息。

如何控制甲基化？

如果不想DNA质粒被甲基化，那么可以通过更换菌种来达到目的。如果你使用的限制性内切酶会被Dam或者Dcm甲基化酶的甲基化所block，那么可以将质粒转化到dam–/dcm–菌株，比如说JM110，然后重新制备质粒。值得注意的是，dam–/dcm–菌株由于缺少Dam的错配修复功能，所以DNA突变几率大增，所以该菌种不适合长期保存质粒。

Souce: 纽普生物    2016-07-15