今天我们讲讲一种很经典的重组子筛选技术——蓝白斑筛选。

先介绍下两种非常常用的蓝白斑筛选质粒pUC18和pUC19。

背景：细菌的乳糖操纵子（lac）包含一个叫lacZ的基因，它编码的蛋白是β-半乳糖苷酶。乳糖操纵子可以被乳糖或者乳糖类似物IPTG给激活，启动下游基因的表达。（严格的来说，IPTG是与lac阻遏物结合，让它失活来启动lac的表达的）。β-半乳糖苷酶可以降解一种连接有染料的底物（X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成半乳糖和一种不溶于水的蓝色色素。

蓝白斑筛选试验

科学家发现，lacZ基因删掉一段（删掉后的突变体命名为lacZΔM15）后编码的突变体β-半乳糖苷酶是没有功能的，当被删掉的一段（命名为α-肽）与lacZΔM15同时在一个细胞内表达的时候，他们可以组合重新恢复功能。这个过程叫α-互补。

根据这个特性，科学家在α-肽的氨基酸加了一个多克隆位点（MCS），如下图左边的黄色楔形。将改造过的α-肽DNA编码片段插入到质粒中，构建了α-克隆载体。当目的基因插入到多克隆位点中，α-肽就变成下图A细胞中所示，不能与细胞的β-半乳糖苷酶突变体结合恢复功能。而如果没有基因插入多克隆位点，也就是空载情况下，α-肽能与细胞中的β-半乳糖苷酶突变体互补而恢复功能（如细胞B所示）。

如下图所示，是一个典型的蓝白斑筛选平板。如果有DNA插入，那么会产生一个没有功能的β-半乳糖苷酶，形成白斑。而如果没有基因插入，即空载情况，会形成α-互补，从而形成蓝斑。值得注意的是，准备这块平板的时候记得要加入IPTG和X-gal底物。

蓝白斑筛选的注意事项

对照：用空载体转化平板，板子上的所有克隆应该都是蓝色。证明IPTG和X-gal都没有问题。

培养时间：一般平板要在培养箱中至少培养16-20小时才可以让细菌表达出β-半乳糖苷酶，从而菌落才能变色。如果平板上的所有克隆子都是白色，这往往是不正常的。

将平板放冰箱冷藏：平台在培养箱过夜培养后放在冰箱中冷藏一会，利于不溶的色素沉淀，从而可以更好的与蓝色菌落区分开。

制作平板的时候要注意：X-gal对光和温度非常敏感，需要在培养基灭菌后再加入。

假阳性：蓝白斑筛选只能证明有DNA插入到MCS，而不能证明插入的就是你的目的DNA片段。

假阴性：这种情况比较罕见，如果插入的片段较小，同时造成通读，而且能与细胞中突变的β-半乳糖苷酶互补。

宿主细胞：宿主细胞得是lacZΔM15基因型的，如XL1-Blue, DH5α, DH10B, JM109, STBL4, JM110, 和Top10

质粒载体：需要含有α-互补克隆的MCS，如pGEM-T, pUC18 and pUC19和pBluescript。

Souce: 纽普生物    2016-07-22