常用的大肠杆菌表达菌株
外源重组蛋白的表达往往表达量非常高,远远超过细菌自身蛋白的表达水平,从而会导致细胞生长缓慢。另外,有些蛋白对细菌有毒性,特别是那些不可溶的,作用于DNA的,以及具有酶活性的。因为这个原因,我们一般会用工程改造的大肠杆菌来表达重组蛋白。
有些很重要的突变可以兼容很高的蛋白表达水平:
ompT:携带这个突变会导致外膜蛋白酶VII的缺失,而外膜蛋白酶VII会降解表达出的蛋白。
hsdSB (rB- mB-): 携带这个突变会形成失活的限制性内切酶/甲基化系统,从而不会让外源DNA被酶切降解及甲基化。
dcm:该突变让细菌不会在特定位点的胞嘧啶上形成甲基化。
表1. 大肠杆菌细胞系
注意:以下所有细胞系都来源于E. coli B, 除了**是K12
细胞系 | 抗性 | 主要特点 | 基因型 | 用途 |
BL21 (DE3) | 能被IPTG诱导,含有T7 RNA聚合酶(DE3) | F- ompT lon hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) | 一般的蛋白表达 | |
BL21 (DE3) pLysS* | 氯霉素 (pLysS) | pLysS表达T7溶菌酶减少本底表达; 表达载体上不能带有p15A 复制原点 | F- ompT lon hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS (CamR) | 表达毒性蛋白 |
BL21 (DE3) pLysE* | 氯霉素 (pLysE) | pLysE有着比pLysS更高的T7溶菌酶的表达水平;表达载体上不能带有p15A 复制原点 | F- ompT lon hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysE (CamR) | 表达毒性蛋白 |
BL21 star (DE3) | 缺少功能性的RNaseE ,导致更长的转录本的半衰期 | F- ompT lon hsdSB (rB- mB-) gal dcm rne131 (DE3) | 常规表达,不适合用于毒性蛋白的表达 | |
BL21-A1 | 四环素 | 阿拉伯糖诱导T7 RNA聚合酶的表达;IPTG对于表达也是必须的。 | F- ompT lon hsdSB (rB- mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA | 常规蛋白表达 |
BLR (DE3) | 四环素 | RecA 缺失;最适合于具有重复序列的质粒 | F- ompT lon hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR) | 表达不稳定蛋白 |
HMS174 (DE3)** | 利福平 | RecA 缺失;适合于在同一细胞系中进行克隆和表达 | F- recA1 hsdR(rK12- mK12+) (DE3) (RifR) | 表达不稳定蛋白 |
Tuner (DE3) | 含有突变的 lac透酶,用于线性控制表达 | F- ompT lon hsdSB (rB- mB-) gal dcm lacY1 (DE3) | 表达毒性或者不可溶蛋白 | |
Origami2 (DE3)** | 链霉素和四环素 | 含有高活性的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶帮助蛋白折叠;可能会增加多聚体的形成 | Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F′[lac+ lacIq pro] (DE3) gor522::Tn10 trxB (StrR, TetR) | 表达不可溶蛋白 |
Rosetta2 (DE3)* | 氯霉素 (pRARE) | 适合于通用的蛋白翻译;包含7中额外稀有密码子的tRNAs;表达载体不能含有p15A 复制原点 | F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR) | 表达真核蛋白 |
Lemo21 (DE3)* | 氯霉素 (pLemo) | 鼠李糖调节的T7 RNA聚合酶的表达,减轻包涵体的形成;表达载体不能含有p15A 复制原点 | fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ?hsdS/ pLemo (CamR) | 表达毒性,不可溶或者膜蛋白 |
T7 Express | IPTG 诱导基因组上的T7 RNA聚合酶的表达;不会形成甲基化的DNA | fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10--TetS) | 常规蛋白表达 | |
m15 pREP4*, ** | 卡那霉素(pREP4) | 顺式抑制大肠杆菌T5启动子,可被IPTG诱导;表达载体不能含有p15A 复制原点 | F-, Φ80ΔlacM15, thi, lac-, mtl-, recA+, KmR | 表达毒性蛋白 |
*:代表该细胞系中含有额外的质粒,为了保持这种特性,请在培养基中加入相应的抗生素;不推荐从这些细胞系中纯化质粒,因为会纯化出这些辅助质粒。
诱导表达过程是如何实现的?
如上表所列,有很多细胞系都是可诱导的,在正常情况下,这些细胞不会启动目的基因的表达,而当加入外源的诱导剂之后,才启动目的基因的转录和翻译。诱导时间很重要,一般在细胞对数生长期的时候才是最好的诱导启动节点。
T7 RNA聚合酶(DE3 lysogen)/T7是最常用的诱导系统了,DE3 lysogen会从细菌基因组上表达T7 RNA聚合酶,lac抑制子能抑制T7 RNA聚合酶对T7启动子下游基因的转录。lac抑制子与乳糖或者乳糖类似物IPTG结合后,会导致T7启动子下游基因的表达。
尽管,T7 RNA聚合酶(DE3 lysogen)/T7系统对绝大部分实验来说work的很好,但是lac启动子会有泄漏,意味着在没有加入IPTG的时候细胞会有泄漏表达。如果目的蛋白是个毒性蛋白,那么泄漏表达会抑制细胞生长,从而菌密度没法提高。这种情况下,一些辅助手段如pLys质粒可以用来抑制T7的表达。pLys质粒含有氯霉素抗性及p15A复制原点。pLys有两种:pLysS和pLysE,区别就是后者有着更高的T7溶菌酶的表达,本底表达更低。
如果蛋白不表达怎么办?
如果蛋白检测不到表达,那么应该看看以下几个方面:
兼容性:检查质粒是否和宿主系统兼容。比如阿拉伯糖诱导的质粒不适合用于IPTG诱导的宿主(DE3);再比如,含有p15复制原点的质粒与pLys细胞株不兼容。所以,有时候需要加入合适的抗性确保质粒没有丢失;如果质粒拷贝数太低,那么可以适当的降低抗生素的浓度。
生长温度:可以小规模测试不同条件下的蛋白表达,如温度,诱导时间,及培养基组分。许多蛋白在30度或者室温条件下表达比较好。
培养基:对许多蛋白而言,丰富培养基如TB或者2XYT是个不错的选择,如果蛋白是分泌表达或者需要缓慢表达的,加入M9盐可能会有帮助
不可溶/分泌表达:检测蛋白是不是发生沉淀了,或者分泌到培养基中去了。毕竟最常见的检测手段都是针对胞内可溶蛋白表达。
不过据我们表达这么多重组蛋白的经验来看,蛋白不表达实在是太常见的。而解决的方法最有效的一般还是在N端融合一些蛋白标签,不仅能帮助蛋白可溶表达,也可以提高蛋白的表达成功率。
Souce: 纽普生物 2016-07-25