1.       什么是包涵体蛋白？

重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达的时候经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。包涵体一般由蛋白质、DNA和脂类物质组成，密度比水大，约1.3mg/ml，易于分离。包涵体蛋白中存在一些与蛋白的天然构象类似的二级结构，所以可以用非变性浓度的去垢剂直接将某些蛋白溶解出来，得到有活性的蛋白质。由于包涵体中通常含有细菌的外膜蛋白OmpT，它是个蛋白酶，能在4-8M尿素条件下降解蛋白质（包涵体溶解，变为可溶，从而被降解）。OmpT的识别的底物蛋白一般是具有双碱性氨基酸，所以包涵体蛋白在溶解之前要么进行洗涤，要么溶解之后要快速进行纯化，不宜长期将溶解的变性蛋白长期保存。

2.       包涵体如何进行洗涤？

包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所 以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。

3.       包涵体如何溶解？

包涵体的溶解一般都用强的变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐, 或去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、对于含有半胱氨酸的蛋白质, 还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫赤藓糖醇和半胱氨酸。温度一般选择在30℃以促进溶解。此外, 由于金属离子具有氧化催化作用, 还常常需要加入金属螯合剂如EDTA、EGTA 以除去金属离子。对于细胞周质内形成的包涵体, 则需采用原位溶解的方法。各种溶解方法都各有利弊, 一般来讲, 盐酸胍优于脲, 因为盐酸胍是较脲强的变性剂,而且脲中常含有的异氰酸盐或酯会不可逆地修饰蛋白质的氨基或巯基。

4.       包涵体蛋白如何复性？

复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开 始，到2M左右时结束；盐酸胍可以从4M开始，到1.5M 时结束。复性方法主要采用稀释复性，透析复性和柱上复性，具体对比如下：

对于含有二硫键的蛋白, 复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有:空气氧化和使用氧化交换系统。氧化交换系统由低分子量的氧化型和还原型的巯基试剂组成。最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG , 而cysteine/cystine 、cysteaminecystamine 、DTT/GSSG、DTE/GSSG 等也都有应用。氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用1 ～ 3 mmol/L 还原型巯基试剂, 还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10∶1 ～ 5∶1。

5.       蛋白复性的常用方法有哪些？

常用的蛋白质复性方法有透析复性、稀释复性和柱上复性，具体为：

稀释复性或透析复性：

在体外复性过程中, 变性的蛋白质要经过一系列的折叠中间体, 最后形成蛋白的天然构象。在蛋白的折叠过程中,部分折叠的中间体的疏水簇外露, 分子间的疏水相互作用引起蛋白聚集。由于聚集是分子间的现象, 聚集反应是二级(或高级)反应, 而正确折叠却是一级反应, 所以,聚集反应更依赖于高蛋白浓度。因此, 减少聚集最直接的方法就是降低蛋白浓度。一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入复性液中。在两次蛋白加入之间, 应有足够的时间间隔使蛋白折叠通过了易聚集的早期中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白共聚集。该方法可提高单位体积的复性液的复性蛋白量。

柱上复性：包括分子筛（凝胶过滤层析）复性、离子交换柱复性和Ni-NTA柱复性。

6.       复性过程中常用的添加剂有哪些？

蛋白复性过程中会添加很多物质来提高复性成功率：

1.       非变性浓度的变性剂：如1M盐酸胍、2M尿素、0.5M的L-精氨酸

2.       盐：硫酸铵

3.       糖类：5-30%的甘油、蔗糖、葡萄糖

4.       去垢剂：Chaps、吐温、Sarkosyl、Triton X-100、OG、DM、DDM、聚乙二醇等

Souce: 纽普生物    2016-08-23