双特异性抗体是一类可以同时特异结合2个不同抗原的双功能的抗体分子。目前，至少有30 多种双特异性抗体药物处于临床研究阶段。
双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备，经过多年的研究及技术发展，双特异性抗体在结构上出现了许多不同的设计策略。按照其是否含有Fc 功能区，主要分为2 类: 含有Fc 区的双特异性抗体和不含Fc 区的双特异性抗体。
1.1 含有Fc 区的双特异性抗体
抗体的Fc结构域的生物学功能有：抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）和补体介导的细胞毒作用（CDC）。双特异性抗体的制备技术手段有以下几种：
Triomabs：Triomabs 通 过Fv 功能区分别结合肿瘤细胞及T 细胞，通过Fc 功能区募集表达FcR的功能细胞，如NK 细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞及树突状细胞等，形成复合体，刺激T 细胞分泌细胞因子清除肿瘤细胞，因此Triomabs 又被称为三功能抗体。Triomabs 双特异性抗体技术平台由德国Fresenius和Trion Pharma 公司合作开发。
Knobs-into-holes：这项技术由Genentech公司开发。具体方法是将其中一个抗体的重链CH3区366 位体积较小的苏氨酸( T) 突变为体积较大的酪氨酸( Y) ，形成突出的“Knobs”型结构( T366Y) ; 同时将另一个抗体重链CH3 区407 位较大的酪氨酸( Y) 残基突变成较小的苏氨酸( T) ，形成凹陷的“holes”型结构( Y407T) ; 利用“Knobs-into-holes”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。突变后，产品正确装配率由野生型的57% 提高至92%，能够满足规模化生产的要求。但重链CH3 的这一改构方式降低了抗体结构的稳定性，为了克服这一缺点，研究者通过噬菌体展示技术进行随机突变筛选，构建了更为稳定的“3 + 1”模式Knobs-holes结构: 即T366W 突变形成突出的“Knobs”型，3 个氨基酸突变( T366S，L368A 和Y407V) 形成凹陷的“holes”型。Knobs-holes结构设计有利于2 种异源抗体重链的装配。
Crossmab: Crossmab 技术的代表产品为罗氏公司的RG7221 和RG7716，两者均为抗Ang-2 /VEGF 双特异性抗体。其结构是在“knobs-holes”结构基础上通过链交换技术，将Ang-2 抗体Fab结构域中的CL 与CH1 互换，而VEGF 抗体的Fab结构则保持不变。经过改造的Ang-2 抗体轻链不易与血管内皮生长因子( VEGF) 抗体的重链发生错配，同时“knobs-holes”结构可促进两条重链异源二聚化。
Ortho-Fab: 该技术是Lewis 等报道的一种克服轻链错配的设计策略。Lewis 等通过计算机模型化并结合X 晶体衍射技术对VH/VL及CH1 /CL 进行正交互补突变设计，从而减少轻链错配现象，将此技术结合重链异源二聚化方法，可以实现双特异性抗体在单一细胞内的高效表达。近期，静电转向技术( electrostatic steering) 也被应用进行Orthogonal Fab 双特异性抗体的构建。
DVD-Ig：是另一种保留抗体Fc 结构域的设计，其结构是在正常抗体轻、重链的N 末端分别再接入另一个抗体的VL 和VH，通过2 个抗体可变区结合双靶点实现双功能。这类分子与现有抗体具有相同的Fc 区，因此可以采用现有通用抗体技术进行生产。
Two-in-one：该技术最早由Genentech 公司Bostrom 等提出，其采用噬菌体展示技术，将与HER2 靶点特异性结合的商业化抗体Herceptin 进行优化，使其能与VEGF特异性结合，同时保留与HER2 的结合能力，从而实现了一个抗体同时结合两个靶点，因此称为Two-in-one双特异性抗体，又称为DAF 抗体( Dual Action Fab，DAF)。Two-in-one 双特异性抗体完全保持了正常IgG 抗体的结构，稳定性良好，而且可以应用常规抗体表达生产技术进行产业化生产，其在下游生产工艺、制剂开发和体内药动学等方面具有突出的优势。
IgG-scFv 及scFv2-Fc：IgG-scFv双特异性抗体是将单链抗体( scFv) 连接在正常IgG 抗体分子的C 末端，通过分子两端的CDR区与靶分子结合实现双功能。而scFv2-Fc 分子与IgG-scFv 结构类似，是将两个scFv 分子分别连接在Fc 功能区的两端，形成双功能区。
1.2 不含Fc 区的双特异性抗体
另一类双特异性抗体不含Fc 区，其优点是相对分子质量小、可以在原核细胞中表达且更易穿过组织及肿瘤细胞到达靶位点; 缺点是由于不含抗体Fc区，不能介导相应的生物学功能且半衰期通常较短，如已上市的Blinatumomab 血液半衰期只有2.11 h，需要通过注射泵连续给药28 d。目前，此类双特异性抗体主要有BiTE，DART，TandAbs， bi-Nanobody 等。
BiTE 双特异性抗体：德国Micromet 公司开发的BiTE系列产品是不含Fc 区结构类双特异性抗体的典型代表。BiTE 是将抗CD3 单链抗体( scFv) 与不同抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体通过肽段进行连接而获得，可同时结合CD3 阳性T 细胞及肿瘤细胞。BiTE 通过结合T 细胞表面CD3，将T 细胞募集至肿瘤细胞表面，从而激活T 细胞进行肿瘤杀伤。BiTE 技术研究者克服了scFv 稳定性差、表达量低、溶解性低等生产问题，成功实现了BiTE 产品的商业化。
DART 双特异性抗体：DART是由MacroGenics 公司和Servier公司联合开发的新一代双特异性抗体构建技术。DART 双特异性抗体是由两条多肽链结合形成的异源二聚体抗体，其结构是将一个抗体可变区的VH和VL 序列分别与另一个抗体可变区的VL 和VH序列连接形成。此外，在两条多肽链的C 末端引入了半胱氨酸，通过半胱氨酸形成链间二硫键，提高产品的稳定性。
TandAbs 双特异性抗体： Affimed 公司开发的TandAbs 双特异性抗体是四价的抗体分子，针对两个抗原各有2 个结合位点。TandAbs 结构为Fv1-Fv2-Fv2-Fv1，是由两分子肽链反向配对形成的同源二聚体分子。TandAbs 相对分子质量约为110 kD，介于全分子抗体及BiTE 之间( 约50kD) ，产品半衰期可达23 h; 同时蛋白无糖基化修饰，产品更为均一，免疫原性低。
bi-Nanobody 双特异性抗体：Nanobody是Ablynx 公司参考骆驼及美洲驼的单域抗体结构( 无轻链及CH1 区) ，通过结构简化，仅保留VH 区而开发的专利平台技术。在实际应用中，Nanobody 是将2 个或多个抗体分子的VH 区进行连接而实现多特异性结合。该类产品的主要优点是分子小、稳定性高、易于人源化、易于连接，并可通过多种途径进行给药。此外，在分子设计时可选择加入与人血白蛋白结合的功能区，将半衰期延长至2 ～ 3 周，并且可以通过白蛋白将药物运输至靶位点。
Souce: 纽普生物 2016-09-08