DNA重组：是指发生在DNA分子内或DNA分子间核苷酸序列的交换，重排和转移现象，是已有遗传物质的重新组合过程。重组可以分为：同源重组（homologous recombination）、位点特异性重组（site-specific recombination）、转座重组（Transpositon recombination)。
位点特异性重组是一种在特定DNA序列之间发生的遗传重组类型，比如λ噬菌体上的attP位点通过Int和IHF蛋白整合到大肠杆菌基因组上的attB位点、P1噬菌体Cre蛋白通过loxP位点介导的DNA重组、酵母的FLP酶通过FRT位点介导的DNA重组。
Flp-FRT 系统和Cre-LoxP系统比较相似，我们一并介绍。
Cre-LoxP系统
Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一种重组酶，于 1981 年从 P1 噬菌体中被发现，其基因编码区序列全长1029bp，为 38kDa 大小的、由 343 个氨基酸组成的多肽单体蛋白。Cre 重组酶的 C-末端结构域包含催化活性位点，能够催化 DNA 分子中特定位点之间的重组。
LoxP 是 Locus of X-overP1 的缩写，是位于 P1 噬菌体中长度为 34bp 的一段序列，由两个 13bp 的反向回文序列和 8bp 的中间间隔序列共同组成，反向回文序列是 Cre 重组酶的识别和结合区域，间隔序列不对称，正是因为这种不对称所以我们可以定义LoxP 序列的方向，链切割和交换就发生再间隔序列内。
LoxP 序列：ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat
图1. LoxP 序列
上图中，红色标记的为反向回文序列，中间黑色的是8bp间隔序列，箭头指示的是切割位点。两个loxP位点的间隔序列一致是发生重组的前提。当间隔序列是对称序列的时候，体外重组结果显示倒置和切除的频率一样。
除了野生型LoxP外，常见的还有 Lox2272，Lox511，Lox5171等等，这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别，但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发生重组。
Lox2272序列：ATAACTTCGTATA ATGTATaC TATACGAAGTTAT
Lox511序列：ATAACTTCGTATA ATGTgTaC TATACGAAGTTAT
Lox5171序列：ATAACTTCGTATA AaGTATcC TATACGAAGTTAT
m2序列：ATAACTTCGTATA AgaaAcca TATACGAAGTTAT
lox71序列：taccgTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT
lox66序列：ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAcggta
备注：lox66和lox71的左侧和右侧回文序列分别有突变。lox66可以和lox71发生重组，但是重组之后，一个产物位点将包含两个突变的回文序列，使得可逆反应被破坏，从而实现稳定的基因重组。
Cre 重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使两个 loxP 位点间发生基因重组。Cre 重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋 DNA。
一般而言，当细胞基因组内存在两个 LoxP 位点时，Cre 重组酶会诱导两个 LoxP 位点间的序列发生重组。首先，Cre 重组酶结合到两个 13bp 的回文序列形成二聚体，然后这个二聚体和另外一个 loxP 位点上的二聚体结合，形成四聚体。LoxP 位点是有方向的，形成四聚体的两个 loxP 位点是平行的，随后这两个 loxP 位点间的双链 DNA 被 Cre 重组酶切掉，然后切口在 DNA 连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于两个 loxP 位点的方向，主要有以下几种可能：
① 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上，且方向相同，Cre 重组酶能有效地删除两个 LoxP 位点间的序列（Deletion）（图2A，图4A）；
② 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上，但方向相反，Cre 重组酶能诱导两个 LoxP 位点间的序列翻转（Inversion）（图2B，图4B）；
③如果两个 LoxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上，Cre 重组酶能诱导两条 DNA 链发生交换或染色体易位，即基因转座（Translocation）（图2C，图4C）
④如果四个 loxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上，Cre 重组酶能诱导 loxP 间的序列互换（cassette exchange）（图2D）。
图2. Cre-loxp重组方式
Flp-FRT 系统
Flp-FRT 系统与 Cre-loxP 类似，也是由一个重组酶和一段特殊的 DNA 序列组成。其中，Flp（flippase recombination enzyme）重组酶，是从酵母细胞内被发现的，其基因全长 1272bp，为 48kDa 大小的、由 423 个氨基酸组成的多肽单体蛋白。
FRT 是 Flp 的识别位点，全长 48bp，由 3 个 13bp 的反向回文序列和 8bp 的间隔序列共同组成。与间隔序列相邻的两个反向回文序列是 Flp 重组酶的识别和结合区域，间隔序列是重组发生的区域，也决定了整个序列的方向。
图3. FRT序列
上图中分别展示的是FRT的完整序列和FRT minimal序列（gaagttcctattctctagaaagtataggaacttc）。完整的FRT序列由3个13bp 的反向回文序列和 8bp 的间隔序列共同组成，其中左边第一个回文序列对于重组不是必须的，可以去除。垂直的箭头表示指示的是切割位点。与LoxP不同的是，FRT的回文序列有一个碱基的不同（上图中灰色背景标注）
除了野生型FRT外，其他常见的FRT突变体有：
F3：GAAGTTCCTATTC TtcAaAtA GTATAGGAACTTC
F5：GAAGTTCCTATTC TtcAaAAg GTATAGGAACTTC
Frt mutant-10：GAAGTTCaTATTC TCTAGAAA GTATAGGAACTTC
Frt mutant+10：GAAGTTCCTATTC TCTAGAAA GTATAtGAACTTC
与Cre-loxp一样，重组仅在同型位点对（如FRT/FRT或F3/F3）之间有效介导，而在异型位点对（如FRT/F3）之间则无法有效重组。这也是重组酶介导的盒式交换（RMCE）技术的基础（图2D）。
Flp-FRT 系统与 Cre-loxP 诱导基因重组的方式类似，这两个系统比较明显的区别是这个重组酶（Cre 和 Flp）具有不同的最佳反应温度，有研究发现，Cre 重组酶的最佳温度为 37℃，而 Flp 重组酶为 30℃。后来科学家们，构建了 Flp 突变体--Flpo，其在 37℃也表现出较好的耐热性。
下图总结了Flp-FRT 系统与 Cre-loxP 诱导基因重组的方式，值得注意的是，FLP和Cre催化的DNA重组都是可逆的。
图4. Cre或者Flp介导的重组
参考文献
1. Hoess RH, Wierzbicki A, Abremski K. The role of the loxP spacer region in P1 site-specific recombination. Nucleic Acids Res. 1986 Mar 11;14(5):2287-300. doi: 10.1093/nar/14.5.2287. PMID: 3457367; PMCID: PMC339658.
2. Branda CS, Dymecki SM. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 2004 Jan;6(1):7-28. doi: 10.1016/s1534-5807(03)00399-x. PMID: 14723844.
Souce: 纽普生物 2024-08-08