CRISPR/Cas系统是在大多数细菌（40%）和古细菌（90%）中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR指的是规律成簇的间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。 Cas（CRISPR-associated genes）为CRISPR相关基因。

当噬菌体感染细菌后，病毒DNA进入细菌细胞内，细菌细胞表达Cas复合体对噬菌体DNA进行切割得到间隔序列（spacer），间隔序列在cas1 和cas2作用下插入到CRISPR序列前导区下游，完成外源DNA的捕获（如图1），形成免疫记忆。

图1. 细菌对噬菌体免疫-Phase 1

当噬菌体再次感染细菌时，以较为简单的Type II型CRISPR/Cas系统为例，细菌表达 tracrRNA、前体crRNA及Cas9蛋白（RNA引导的核酸内切酶），tracrRNA和crRNA由于部分序列互补而结合，Cas9与tracrRNA和crRNA形成复合体并由Cas9加工成为成熟crRNA-tracrRNA Cas9复合体，成熟复合体由间隔序列引导识别病毒靶序列，并切断病毒DNA（如图2）。复合体只能识别与间隔序列一致并且3'端含PAM（protospacer adjacent motif，原间隔序列邻近模块序列）的靶序列，这是CRISPR/Cas9不剪切自身间隔序列的原因。不同来源CRISPR/Cas9系统有不同PAM序列，如链球菌CRISPR/Cas9系统PAM序列为NGG。

图2. 细菌对噬菌体免疫-Phase 2

CRISPR/Cas可分为二大类群：Class 1以多个Cas组成的效应复合体行使功能为特征，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；Class 2则只需单个多结构域的Cas，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型（表1）。Class 2系统简单、高效、操作方便，是目前主要的基因编辑系统，其中最具代表性的是Cas9。

本文主要讲解Cas9。

如图3所示，CRISPR-Cas9系统由三部分组成，crRNA（读作CRISPR RNA）、tracrRNA（读作tracer RNA）和Cas（CRISPR-associated）核酸酶。crRNA和tracrRNA一起组成gRNA（guide RNA，向导RNA）。图3左边是自然界gRNA的结构，右边是人为制造的gRNA，将crRNA和tracrRNA融合为一条链（又称为sgRNA）。

gRNA 骨架部分与Cas核酸酶相对应。不同的Cas核酸酶结合不同的gRNA 骨架。

图3 CRISPR-Cas9系统

下图以更加具体的例子来说明CRISPR-Cas9系统。

图4. CRISPR-Cas9 system

Cas9蛋白结合sgRNA通过20nt长的向导RNA（蓝色）与人EMX1基因DNA结合；红色部分是sgRNA的骨架；粉色标记的是PAM序列，此处为TGG；Cas9会在PAM序列的上游约3bp出会产生一个双链断裂（DSB），图中红色箭头指示DSB断裂处。

图5 spCas9 的gRNA

如果要亲手设计gRNA，那还是又必要详细了解下Cas9 gRNA的结构。如上图所示，这是一个spCas9 的gRNA，其中1-32位是crRNA；37-100位是tracrRNA。Briner et al.在crRNA和tracrRNA之间加上了GAAA linker，使得这两个RNA形成单一一条RNA。这样做的目的是简化CRISPR系统，这样就可以不用表达三样东西，如Cas9，tracrRNA和crRNA，而只用表达Cas9和sgRNA这两样。从效率上来说，会提高不少。我们通常说的gRNA设计，其实设计的是1-20位，也就是Spacer部分，其余的部分是固定的，称为sgRNA scaffold。不同种属来源的Cas9的sgRNA scaffold序列不一样。

SpCas9（常用的有两个版本）

Chen（2013）:

GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

Hsu (2013):

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT

SaCas9

GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT

FrCas9

GTTTGAGTGTCTTGTTAAGAAATTAACAAGATGAGTTCAAATCAGGCTCCTAGAGAGATCCGAACTTACCTTCATGGCGGGCATTGTGCCCTTTTTT

由于Cas9会在PAM序列的上游约3bp出会产生一个双链断裂（DSB），细胞主要启动两种“DNA修复”细胞信号转导通路：同源重组修复（HDR）与非同源末端连接（NHEJ）。

HDR需要我们额外提供同源模板，如果没有同源模板，NHEJ通路发挥功能，断裂的两条DNA直接连接，同时会产生几个碱基的插入或者删除，只要插入/删除的碱基数不是3的倍数（概率为三分之二），同时DSB在蛋白的编码区，那就有可能产生移码，使得蛋白失去功能，从而达到knockout（ko）的目的。所以，为了实现CRISPR ko，Spacer应该尽量避免设计在太靠近氨基端（下游的ATG可能起始翻译）或者太靠近羧基端的位置，更稳当的做法是设计几条gRNA，产生好几个DSB。

如果想通过HDR进行基因编辑，比如引入荧光标签，靶位点的选择很大程度上受到编辑所需位置的限制；当切割位点距离修复模板的近端> 30nt时，效率急剧下降(Yang et al , 2013)。

如果我们让Cas9失去切割双链DNA的能力，也就是不引起DSB，但仍能在gRNA的引导下，特异性地结合到目标DNA序列上，就可以实现CRISPRa (激活)和CRISPRi (抑制)技术，可以在转录水平调控基因表达。首先，我们需要一个dCas9蛋白（没有切割活性的Cas9），它是在野生型Cas9的两个关键核酸酶活性位点（RuvC和HNH）引入突变（如D10A和H840A）后得到的。当dCas9被引导到靶基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB结构域，这样的蛋白称之为dCas9-KRAB，可以进一步提高转录抑制的效率。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。

当dCas9连上转录激活子（如VP64、p65和HSF1），通过gRNA引导dCas9到目标基因的启动子或增强子区域，来激活基因的转录。这些激活因子通过吸引转录机器（如RNA聚合酶和其他转录因子）增加目标基因的转录水平。

对于CRISPRa，靶向转录起始位点(TSS)上游~100nt的窗口是最有效的，而对于CRISPRi，位于TSS下游~100nt的窗口，具有最高的活性。因此要设计CRISPRa或者CRISPRi的gRNA，需要知道转录起始位点信息。

gRNA的脱靶活性是需要重点考虑的。研究表明引导序列 3'端的 8-14 个碱基对错配的容忍度低于 5'端的碱基；一般来说，超过三个错配是不能容忍的；一些引导序列对错配的容忍度低于其他引导序列；脱靶切割对转染量以及 Cas9 和 sgRNA 的相对比例高度敏感。

了解完设计的基本原则后，就可以借助在线工具进行gRNA设计了，比如CRISPick。

表1. Class 2 CRISPR system

CRISPR系统	类型	分类	核酸酶结构域	PAM/PFS	向导RNA	是否需要tracrRNA	向导RNA长度	靶向	反式切割
Cas9	Class 2	Type II-A	HNH and RuvC	NGG	sgRNA	是	~100 nt	dsDNA	无
Cas12a (Cpf1)	Class 2	Type V-A	RuvC	(T)TTN	crRNA	否	40-44 nt	ds/ssDNA	ssDNA
Cas12b	Class 2	Type V-B	RuvC	TTTN	crRNA	是	40-44 nt	ds/ssDNA	ssDNA
Cas13a (C2c2)	Class 2	Type VI-A	2 x HEPN	non-G	crRNA	否	64-66 nt	ssRNA	ssRNA
Cas13b(C2c4)	Class 2	Type VI-B	2 x HEPN	non-C or NANF/NNA	crRNA	否	58-66 nt	ssRNA	ssRNA
Cas14a (Cas12f1)	Class 2	Type V-F1	RuvC	无	crRNA	是	~140 nt	ssDNA	ssDNA

请注意，表格中的"dsDNA"代表双链DNA，"ssDNA"代表单链DNA，"ssRNA"代表单链RNA，"PAM"代表原间隔序列(protospacer-adjacent motif)，"PFS"代表前间隔序列侧翼位点(protospacer flanking sequence)。"反式剪切"(trans-cleavage)指的是CRISPR-Cas系统在切割目标DNA或RNA后，是否还能进一步切割其他非目标序列。CRISPR-Cas切割目标DNA或者RNA称为顺式剪切（cis-cleavage）

Souce: 纽普生物    2024-08-13