研究基因功能最常见的方法是，减少或者阻断基因表达，然后进行表型分析。十多年来，RNAi一直是这一领域的王者，然而新兴技术的涌现（尤其是CRISPR技术）正在逐渐瓦解RNAi的统治地位。日新月异的技术发展为生物学研究提供了越来越大的助力，也给研究者们带来了一个有些纠结的问题，“到底应该选择那一种技术呢”。
RNAi
RNAi（RNA interference, RNA干扰）技术利用双链小RNA（dsRNA）高效、特异性的降解细胞内同源mRNA从而阻断基因表达。RNAi普遍存在于几乎所有真核生物中，RNAi只是敲降基因表达（knock down，KD）。
RNAi 的基本过程：dsRNA/shRNA被Dicer酶切割为21-23 nt大小的siRNA片段，siRNA双链在细胞质中结合一个核酶复合物形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。解旋酶将siRNA双链解旋为单链，单链中的引导链（Guide strand）与靶mRNA通过碱基互补配对而结合，在ATP供能的情况下，RISC中核酸内切酶slicer切割靶mRNA，将mRNA切割降解，阻止其翻译，引起靶基因转录后水平的沉默。在细胞中引入shRNA（细胞内转录形成）和siRNA（化学合成）是两种常见的RNAi方法。
RNAi技术的特点
高效性：细胞内的RNAi途径存在级联放大效应，极少量的dsRNA经起始阶段—效应阶段—扩增阶段的循环就能产生强烈的RNAi效应，以维持高效的干扰作用。
特异性：RNAi只特异地降解同源mRNA，而其他mRNA表达则不受影响，从而准确沉默目的基因。但是自发现以来，在使用 RNAi 作为研究基因功能的工具时，脱靶效应日益受到关注。研究发现，siRNA 可诱导序列互补性有限的非目标 mRNA 沉默，通常是通过与 3′UTR 的相互作用。
位置效应：Holen等根据TF（Tissue factor）不同位置的dsRNA对基因沉默效率的影响，结果表明dsRNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。
可传播性：可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，使RNAi扩散到整个机体并可传递给子代。
简便性：RNAi 的一大优势是沉默机制几乎存在于所有真核生物中。因此，无需事先对目标细胞系进行遗传操作，简单的 siRNA 转染就能导致功能缺失表型。
RNAi 机制似乎主要活跃于细胞质中，核内转录本（例如长非编码 RNA 或 lncRNA）可能更难有效靶向。CRISPR技术可以靶标细胞核内的转录本。
CRISPRko和CRISPRi
CRISPR系统有两种技术对基因的表达进行调低，分别是CRISPRko和CRISPRi。CRISPRko是通过Cas9蛋白结合sgRNA对目标DNA产生双链断裂，细胞通过非同源重组的末端连接（NHEJ）途径修复双链断裂会产生编码区移码，使得翻译产生的蛋白失去功能，实现的效果是knockout。sgRNA结合的靶位点应该设计在外显子区域，不要太靠近蛋白氨基端或者羧基端。sgRNA结合的靶位点在正义链还是反义链都不影响最终的效果。
CRISPRi则是通过dCas9蛋白结合sgRNA结合到转录起始位点附近，抑制基因的转录，实现的效果是knockdown；为了增强抑制效果，一般会在dCas9的C端融合KRAB蛋白。sgRNA结合的靶位点应该设计在转录起始位点（TSS）附近。
与 RNAi 相比，CRISPR在使用相同数量的效应 RNA 的情况下，似乎能产生更一致、更稳健的基因敲除/敲降效果，另外脱靶效应也比RNAi低的多。
下表总结了RNAi与CRISPR技术的异同点。
| RNAi | CRISPRi | CRISPRko | |
| 功能缺失-表型 类型 | 可逆 | 可逆 | 不可逆 |
| 实验简便性 | 简单 | 中等 | 中等 |
| 成本 | 低 | 低 | 低 |
| 脱靶 | 高 | 低 | 低 |
| 发挥功能的位置 | 细胞质 | 细胞核 | 细胞核 |
| 起作用的分子 | siRNA | dCas9+sgRNA | Cas9+sgRNA |
参考文献
Boettcher M, McManus MT. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 2015 May 21;58(4):575-85. doi: 10.1016/j.molcel.2015.04.028. PMID: 26000843; PMCID: PMC4441801.
Wang F, Guo T, Jiang H, Li R, Wang T, Zeng N, Dong G, Zeng X, Li D, Xiao Y, Hu Q, Chen W, Xing X, Wang Q. A comparison of CRISPR/Cas9 and siRNA-mediated ALDH2 gene silencing in human cell lines. Mol Genet Genomics. 2018 Jun;293(3):769-783. doi: 10.1007/s00438-018-1420-y. Epub 2018 Jan 30. PMID: 29383448.
Souce: 纽普生物 2024-08-14