四环素调控系统的来源和原理

四环素阻遏蛋白（TetR）/操纵子（TetO）是大肠杆菌在遇到四环素时激活四环素解毒的天然机制。在没有四环素的情况下，TetR 会表达并形成同源二聚体，并以高亲和力与两个四环素操作端 tetO1 和 tetO2 结合，这导致四环素外排转运体 TetA 转录和翻译受抑制。如果存在四环素，它就会通过细胞膜扩散，并可逆地抑制氨基酰-tRNA 与 mRNA 核糖体的结合，从而阻碍蛋白质的生物合成。当存在 Tet 系统时，四环素与 Mg2+ 形成复合物（红色三角形）。该复合物与 TetR 结合，导致抑制因子发生构象转换，导致抑制因子 TetR 与 tetO 操作子分离，从而导致 TetA 的表达。TetA 被整合到细胞质膜中，作为一个反转运体将四环素复合物转运到外部，从而使蛋白质的生物合成得以进行。

因此，四环素调控系统有三个关键元素：tetR、tetO和四环素，我们分别阐述。

四环素类抗生素

四环素类抗生素（Tcs）是一类广谱抑菌剂，是目前世界上应用最广泛的抗生素之一。用作调控基因开关的四环素类抗生素有：四环素（Tetracycline）、四环素的衍生物多西环素（Doxycycline）。其中多西环素（Dox）是四环素调控系统的首选效应物。多西环素与 tTA 和 rtTA 的结合亲和力很高；因此，多西环素既可用于四环素开启系统，也可用于四环素关闭系统。

此外，Dox 还具有良好的组织分布性、低毒性、已知的半衰期（24 小时）以及相对低廉的价格。

其他四环素衍生物的诱导概况可参见 Krueger et al, 2004[1]。

某些细胞培养血清可能含有四环素或其衍生物，这可能会导致意外的系统诱导。请调查您的血清是否不含四环素。

tetO

在大肠杆菌中，tetO分为tetO1和tetO2，其中tetO2 与 TetR 的结合更强[2]，并且对天然四环素操纵子系统的整体行为具有更强的影响[3]，因此常见的调控质粒中的tetO一般都是tetO2。tetO2序列：TCCCTATCAGTGATAGAGA。一个tetO2可以结合一个TetR二聚体。Invitrogen T-REx 系统中使用了2个拷贝的 Tet 操纵子 2 (tetO2) 序列，比如pcDNA4/TO质粒，2个TetO2紧挨着CMV启动子的下游。另外非常常见的是含有TRE的一些元件，比如tight TRE promoter、TRE3G BI promoter、TRE3G promoter、TRE3GS promoter、TRE3GV promoter、TREmod/U6 promoter等，它们都是由7个拷贝的tetO2与不同的启动子组合在一起形成的四环素反应元件（Tetracychne Response Element, TRE）。

TetR

我们在一些四环素调控系统能看到诸如TetR（比如pcDNA6/TR），Tet-On(R) 3G（比如pLVX-TetOne-Puro）、tTA-Advanced（比如pTet-Off-Advanced）、tTA（比如pTet-Off）、rtTA（比如rtTA）、rtTA-Advanced（比如pTet-On-Advanced）等元件。它们有什么联系和区别呢？

tTA（tetracycline-controlled transactivator）：由TetR与单纯疱疹病毒 VP16 的强转录激活结构域融合而成。在没有四环素的情况下，tTA 的 tetR 部分会与这些 tetO 序列结合，激活结构域会促进表达。在有四环素的情况下，四环素会与 tetR 结合。这就阻止了 tTA 与 tetO 序列的结合，从而导致基因表达量减少。这种加入四环素/Dox会导致基因表达的关闭称为Tet-Off。

rtTA（reverse tetracycline-controlled transactivator）：与 tTA 类似，rtTA 也是由 TetR和 VP16 转录激活结构域组成的融合蛋白；不过，tetR DNA 结合分子中的四个氨基酸突变（E71K、D95N、L101S、G102D）改变了 rtTA 的结合特性，使其只能在存在四环素或者Dox的情况下识别目标转基因 TRE 中的 tetO 序列。这种加入四环素/Dox会导致基因表达的开启称为Tet-On。

rtTA-Advanced、tTA-Advanced：与不带Advanced版本相比，有两方面改变。一个是编码DNA序列，Advanced 载体经过了优化，利用了人类密码子偏好，去除了转录激活子 mRNA 序列中的隐性剪接位点，从而提高了在哺乳动物细胞中的表达量；另外一个方面是转录激活结构域的氨基酸序列，最大程度地减少了脱靶效应并降低了毒性。

参考文献

1. Krueger C, Pfleiderer K, Hillen W, Berens C. Tetracycline derivatives: alternative effectors for Tet transregulators. Biotechniques. 2004 Oct;37(4):546, 548, 550. doi: 10.2144/04374BM04. PMID: 15517964.

2. Kedracka-Krok S.; Wasylewski Z. Kinetics and equilibrium studies of Tet repressor-operator interaction. J. Protein Chem. 1999, 18, 117–125.

3. Weeding E.; Houle J.; Kaznessis Y. SynBioSS designer: a web-based tool for the automated generation of kinetic models for synthetic biological constructs. Briefings Bioinf. 2010, 11, 394–402.

Souce: 纽普生物    2024-09-27