慢病毒和逆转录病毒均属于逆转录病毒科。慢病毒是逆转录病毒的一种,它之所以称为慢病毒,是因为这些病毒具有长达数年的潜伏期,其中人HIV,猴SIV,猫FIV都是慢病毒。
慢病毒和逆转录病毒典型特征为其 RNA 基因组能逆转录为 cDNA 副本,cDNA 副本又能稳定整合至宿主细胞基因组中(这就是常说的稳转)。逆转录病毒通常分两种:简单的(如γ-逆转录病毒,如MMLV、MSCV等)和复杂的(如慢病毒)。当科学家们讨论逆转录病毒时,他们通常指的是γ-逆转录病毒。
图1. 逆转录病毒的结构
逆转录病毒基因组结构较简单,通常编码基本基因 gag(结构蛋白)、pol(酶,如逆转录酶和整合酶)和 env(包膜蛋白),但缺乏慢病毒中的额外调节蛋白。
慢病毒基因组一般较为复杂,编码额外的调控蛋白(如 HIV 中的 Tat 和 Rev),这些蛋白参与调控病毒的生命周期并提高复制效率。
逆转录病毒通常情况下,只能感染分裂细胞,因为它们的预整合复合物无法穿过非分裂细胞的核膜。这就限制了它们在涉及快速分裂细胞的应用中的使用。
慢病毒既能感染分裂细胞,也能感染非分裂细胞。这使它们在基因治疗和研究应用中具有高度的通用性,因为在这些应用中需要以非分裂细胞(如神经元或造血干细胞)为靶标。
图2. 逆转录病毒质粒系统
γ-逆转录病毒包装系统
γ-逆转录病毒(γ-逆转录病毒)在癌症和干细胞研究中的广泛应用,其包装系统包括:
编码转基因、sgRNA 或 shRNA 的γ-逆转录病毒转运质粒: 转基因序列两侧有长末端重复序列(LTR),这有利于转运质粒序列整合到宿主基因组中。通常情况下,病毒转导时整合到宿主基因组中的是介于 LTR 之间(包括 LTR)的序列。
包装基因(病毒 Gag-Pol): Gag 是一种结构性前体蛋白,Pol 是一种聚合酶。
包膜基因: 使用 VSV-G 包膜可提供最广泛的适用性或病毒可感染的细胞范围。
注:虽然慢病毒和γ-逆转录病毒都使用相同的基因产物(即 Gag、Pol 和 Env)进行包装,但这些蛋白的变体以及病毒的 LTR 却各不相同。因此,慢病毒和γ-逆转录病毒包装质粒不能互换(不同γ-逆转录病毒包装质粒可以互换)。不过,VSV-G 等通用包膜质粒可在两种系统中使用。
病毒的包膜蛋白决定了病毒侵染的宿主范围,目前,根据逆转录病毒基因转移系统的亲嗜性,可分为4种:① 单嗜性(Ecotropic),包膜蛋白为env(gp70),只能感染小鼠和少数品种的大鼠细胞;② 双嗜性(Dualtropic),包膜蛋白采用鼠白血病病毒的包膜蛋白4070A,能同时感染小鼠和人的细胞;③ 多嗜性(Amphotropic),包膜蛋白采用鼠白血病病毒的包膜蛋白10A1,既能感染小鼠和人的细胞,也能感染其它哺乳动物细胞;④ 泛嗜性(Pantropic),包膜蛋白采用水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG),它侵染宿主细胞时,不是与细胞膜上的受体结合,而是直接与脂质结合,然后穿过细胞膜进入宿主细胞,从而扩大了其宿主范围,既能感染哺乳动物细胞,也能感染鱼类等非哺乳动物细胞。
常用γ-逆转录病毒包膜及包装质粒
质粒名称 |
类型 |
描述 |
pUMVC |
包装质粒 |
表达MoMLV gag 和pol; 和包膜质粒一起用 |
pCL-Eco |
包装质粒 |
表达MoMLV gag, pol, 和env;不需要包膜质粒 |
pBS-CMV-gagpol |
包装质粒 |
MoMLV gag 和pol |
pCMV-VSV-G |
包膜质粒 |
表达VSV-G包膜; 和包装质粒一起用 |
pMD2.G |
包膜质粒 |
表达VSV-G包膜 |
pCI-VSVG |
包膜质粒 |
表达VSV-G包膜;推荐用于FELIX系统 |
pCAG-Eco |
包膜质粒 |
表达单嗜性MLV 包膜的质粒 |
pCAG-VSVG |
包膜质粒 |
表达VSV-G包膜 |
pHEF-VSVG |
包膜质粒 |
表达VSV-G包膜 |
注:MMLV的gag-pol可以用于MCSV的包装;比如用pCL-Eco来包装MCSV
常用γ-逆转录病毒转移质粒
质粒名称 |
5’LTR种属 |
描述 |
pBABE-puro |
MoMLV |
转基因表达,嘌呤霉素抗性筛选 |
pBABE-neo largeTcDNA |
MoMLV |
表达大 T 抗原以创建永生化细胞 |
pBABE-hygro-hTERT |
MoMLV |
表达 hTERT,用于创建永生细胞; |
pMKO.1 GFP |
MoMLV |
U6启动子用于表达shRNA,也表达GFP |
MSCV-IRES-GFP |
MSCV |
用于转基因表达和 GFP 标记 |
pMSCV PIG (Puro IRES GFP empty plasmid) |
MSCV |
用于克隆和基因表达;用嘌呤霉素筛选或GFP筛选 |
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE |
MSCV |
条件性过表达质粒;通过 Cre 重组酶删除 dsRed 会导致 dsRed 快速消失,并激活与 eGFP 表达融合的基因。 |
MSCV IRES Luciferase |
MSCV |
转基因表达质粒;也表达荧光素酶 |
pMIG |
MSCV |
转基因表达质粒;也表达 GFP。 |
MDH1-PGK-GFP_2.0 |
MSCV |
用于表达 miRNA 的逆转录病毒质粒 |
pMSCV-IRES-mCherry FP |
MSCV |
包含IRES-mCherry的表达质粒 |
TtRMPVIR |
CMV/MSV |
Tet调控的shRNA表达质粒 |
pRetroX GFP T2A Cre |
CMV/MSV |
四环素诱导表达的GFP-T2A-Cre |
pRXTN |
CMV/MSV |
pRXTN 是 pRX-tight Puro 的改进版,编码 NAT 而不是 PAC |
pLncEXP |
CMV/MSV |
lncRNA 表达质粒 |
pLXIN-Luc |
MoMSV |
在哺乳动物细胞中稳定表达荧光素酶 |
Souce: 纽普生物 2024-11-15