环状 RNA（circRNA）是一类具有共价闭合单链结构的非编码 RNA，在很长一段时间内被认为不具备蛋白编码潜力。然而，近年来的大量研究证实，部分 circRNA 可突破传统认知，通过内部核糖体进入位点（IRES）等非帽依赖机制启动翻译过程，生成具有生物学功能的蛋白质或多肽，这一发现为 RNA 功能研究及生物制药领域开辟了新的方向。

一、circRNA 的生物发生与分子特征

（一）核心生成机制

circRNA 的生成途径具有多样性，其中真核生物中最主流的方式是在细胞核内通过前体 mRNA（pre-mRNA）的反向剪接（back-splicing）产生。反向剪接的核心是让下游外显子的 5' 剪接位点与上游外显子的 3' 剪接位点近距离靠近，该过程主要依赖两类驱动因素：一是两侧内含子的互配作用，如 Alu 反向重复序列或其他互补序列可直接驱动 RNA 成环；二是蛋白辅助作用，MBL、QKI、FUS、NOVA2 等蛋白形成的二聚体可将 RNA 两端 “拉近” 以促进成环，而 ADAR1 或 DHX9 蛋白的解旋作用则会抑制成环过程。

除反向剪接外，circRNA 还可通过其他途径生成：其一为套索残留机制（lariat escape），当脱支酶 DBR1 未能成功识别 pre-mRNA 剪接产生的套索结构时，套索经修剪后可形成 circRNA（这类 circRNA 被称为 ciRNA）；其二为 tRNA/rRNA 加工副产物途径，该途径可产生 tricRNA 以及古菌中的 16S/23S 环状中间体。

（二）分类与结构特征

根据成熟 circRNA 中是否包含内含子，可将其分为外显子 circRNA（EcircRNAs）和外显子 - 内含子 circRNA（EIciRNAs）。所有类型 circRNA 的化学本质均为共价闭合的单链 RNA，其显著结构特征是缺少 5′-cap（帽子结构）与 3′-poly (A)（多聚腺苷酸尾），这一结构特点赋予了 circRNA 独特的稳定性：

抵抗 3′→5′外切酶（如 XRN1、XRN2）的降解；

抵抗 5′→3′外切酶（如 DOM3Z/Rat1）的降解；

因此，circRNA 的半衰期可达 19–24 小时，而对应的线性 mRNA 半衰期仅为 4–7 小时，这种高稳定性为其发挥长期生物学功能提供了基础。

二、circRNA 翻译的分子机制

真核生物中 95% 以上的翻译过程依赖 “帽依赖” 途径（上图a）：5′-cap 与 eIF4E 结合，再通过 eIF4G 与 3′-poly (A) 结合的 PABP 相互作用形成 “闭环” 结构，进而招募 43S 前起始复合物扫描 mRNA 上的 AUG 起始密码子以启动翻译。由于 circRNA 缺乏 5' 帽子结构和 3'poly (A) 尾，无法通过这一经典途径启动蛋白合成，其翻译依赖内部核糖体进入等非经典机制，核心分子元件和调控因子如下（上图b）：

（一）内部核糖体进入位点（IRES）介导的翻译启动

内部核糖体进入位点（IRES）是一类位于 RNA 内部的二级或三级结构元件，能够不依赖 5' 帽子结构直接招募 40S 核糖体亚基，从而启动翻译过程。经典 IRES 最初在病毒基因组 RNA（如小核糖核酸病毒）中被发现，后续研究证实真核生物内源 circRNA 中也存在功能性 IRES。

高通量筛选已鉴定出约 17000 个潜在 IRES 序列，其中与 18S rRNA 互补的序列、茎环结构元件（SuRE）以及多聚尿嘧啶（poly (U)）基序等可显著促进 circRNA 翻译。例如，circZNF609 的非翻译区（UTR）包含功能性 IRES，且该 IRES 的活性依赖剪接过程；circPINTexon2 的 IRES 上游存在短开放阅读框（ORF），可编码由 87 个氨基酸组成的功能多肽。此外，短核苷酸串联重复序列可通过重复相关非 AUG（RAN）翻译启动 circRNA 表达，该机制不依赖经典的 AUG 起始密码子，且与多种人类遗传病的发生发展相关。

（二）N⁶- 甲基腺苷（m⁶A）修饰的调控作用

N⁶- 甲基腺苷（m⁶A）是真核生物 mRNA 中最丰富的内部修饰，同样在 circRNA 翻译调控中发挥关键作用，其调控过程依赖一系列特异性分子：m⁶A 甲基转移酶（Writer）包括 METTL3/14 复合物；去甲基化酶（Eraser）包括 FTO 和 ALKBH5；识别蛋白（Reader）包括 YTHDF1/2/3、eIF3 以及 METTL3 本身。m⁶A 的核心基序为 RRACH 或 DRACH（其中 R=A/G、H=A/C/U、D=A/G/U）。

m⁶A 修饰对 circRNA 翻译的调控机制主要包括：YTHDF1、YTHDF3 等识别蛋白可特异性结合 circRNA 中的 m⁶A 位点，进而招募翻译起始因子 eIF3 和 eIF4G2，促进 40S 核糖体通过内部进入方式启动翻译；m⁶A 甲基转移酶 METTL3 可与 eIF3h 相互作用，帮助形成有利于翻译的 mRNA 环状结构，从而增强 circRNA 的翻译效率。此外，m⁶A 修饰在 circRNA 中的分布位置（如 5'UTR 或编码区）会影响翻译起始的效率和特异性，为 circRNA 翻译的精准调控提供了分子基础。

（三）外显子连接复合体（EJC）的介导作用

外显子连接复合体（EJC）是 mRNA 剪接后沉积于外显子 - 外显子连接上游 20-24 核苷酸处的多蛋白复合体，主要由 eIF4A3、Y14、MAGOH 和 MLN51 四种蛋白组成。在 circRNA 通过反向剪接生成的过程中，EJC 可沉积于反向剪接连接位点（BSJ）附近，通过 eIF4A3 与 eIF3g 的相互作用招募 eIF3 复合体和 40S 核糖体，从而启动内部翻译。

研究证实，内源性 circRNA 与多聚核糖体的结合依赖 eIF4A3，而 EJC 组件的存在可显著增强这一相互作用。此外，eIF3j 作为 eIF4A3 的抑制因子，可促进 eIF3 复合体与 circRNA 的解离，进而负向调控 circRNA 的翻译起始过程；eIF4A3 的磷酸化修饰还可影响 EJC 的装载效率，使 circRNA 翻译呈现细胞周期依赖性调控特征。

（四）核糖体结合后的翻译完成过程

40S 核糖体与 circRNA 结合后，还需经历扫描与起始密码子识别、60S 核糖体结合与肽键形成等关键步骤，最终完成蛋白合成：

扫描与 AUG 识别：circRNA 的翻译起始仍遵循 Kozak 语境（核心序列为 gccAUGg），但由于缺少帽依赖途径的 “扫描锁” 机制，非 AUG 启动（如 CUG、GUG、AUA）的发生率为 5–10%，显著高于线性 mRNA。

60S 结合与肽键形成：这一过程与线性 mRNA 的翻译完全一致，但由于 circRNA 为环状结构，没有翻译终止后的核糖体解离信号，因此会出现两种特殊结局：

滚环翻译（Rolling-circle translation）：翻译过程无终止信号，核糖体围绕 circRNA 循环移动，持续合成多聚体蛋白；

-1 核糖体移码（-1PRF）逃逸：核糖体在翻译过程中发生滑移，产生异位终止密码子，使多聚体蛋白得以释放，同时避免持续翻译导致的细胞毒性。

三、circRNA 翻译的关键调控因素

（一）开放阅读框（ORF）的结构特征

circRNA 的开放阅读框（ORF）结构直接影响其翻译效率和自身稳定性，其结构由起始密码子（AUG 或非 AUG）、终止密码子（UAA、UAG、UGA）与反向剪接连接位点（BSJ）的相对位置决定：当终止密码子位于 BSJ 下游且 EJC 保留时，circRNA 可被无义介导的 mRNA 降解（NMD）途径识别并降解；若 BSJ 位于终止密码子上游，延伸的核糖体可置换 EJC，使 circRNA 逃避 NMD 降解并稳定存在。

部分 circRNA 缺乏终止密码子，可通过滚环翻译生成高分子量的多聚体蛋白，而 - 1 核糖体移码（-1PRF）机制可产生框外终止密码子，终止持续翻译过程。此外，circRNA 的 ORF 可通过反向剪接形成新的融合序列，编码具有独特功能的嵌合蛋白，例如 circSMO 通过外显子 3-6 的反向剪接形成新 ORF，可编码由 193 个氨基酸组成的嵌合蛋白，该蛋白在相关生理病理过程中发挥特异性作用。

（二）表达系统的优化

传统的 circRNA 表达系统（如 ZKSCAN1 内含子系统、RBP 辅助系统等）存在显著缺陷，不仅生成 circRNA 的效率较低，还易产生超过 95% 的线性 RNA 副产物，严重限制了 circRNA 的应用。Tornado 系统的出现有效解决了这一问题，该系统通过在 RNA 两端引入 Twister 核酶序列，转录后核酶发生自催化切割，再由内源性连接酶 RtcB 介导环化，可在哺乳动物细胞中高效生成 circRNA，真环比例超过 90%，产量较传统反向剪接系统提升 220 倍。

Tornado 系统的优化组合（CMV 启动子 + CVB3 IRES）可实现高水平蛋白表达，且表达产物可包装入病毒样颗粒（VLPs），显著延长蛋白表达持续时间。此外，Pol III 启动子（如 U6）可提高 circRNA 的转录水平，但需对 IRES 进行突变以去除 Pol III 终止信号（如 EMCV IRES 突变体 mutEMCV），从而平衡转录效率与翻译活性。

（三）Tornado 系统的应用最佳实践

基于现有研究，Tornado 系统的优化应用需关注以下关键参数：

启动子选择：CMV 启动子（Pol II）可兼顾转录水平与翻译效率，是通用性优选；U6 启动子（Pol III）虽能显著提高 RNA 产量，但翻译效率较低，适用于特定高转录需求场景。

IRES 选择：不同 IRES 的促进翻译活性存在差异，优先级为 CVB3 > HRV-B3 > EMCV；若采用 Pol III 启动子，需将 EMCV IRES 中的 UUUU 序列突变为 UUCUCU，以避免 Pol III 介导的转录提前终止。

环化柄（stemforming）长度：18 bp 的环化柄已能满足基本环化需求，26 bp 的环化柄效果略优，而 49 bp 的环化柄未显示进一步提升，可通过 mFold 或 RNAfold 等生物信息学工具进行优化设计。

连续翻译（NO-STOP）优化：HCV-IRES 的终止密码子突变后，连续翻译效率仅提升 50%；内源 LIMA1-IRES 的连续翻译效率可提升 90 倍，但绝对值仍远低于 CVB3 IRES，因此 CVB3 IRES 仍是连续翻译场景的优选。



以 pcDNA3.1+-Tornado-nLuc 质粒为例，该质粒全长 7008 bp，其核心结构及工作原理如下：质粒转入哺乳动物细胞后，CMV 启动子启动转录，生成的 mRNA 结构为 “Ribozyme-stemforming-IRES-Nluc-stemforming-Twister Ribozyme”。转录完成后，两个 Ribozyme 发生自剪切并脱离 mRNA，剩余片段的两个 stemforming 区域形成茎环结构（设计时建议每 10 个碱基插入凸起（bulge），可优化茎环结构稳定性，避免过度配对导致的结构僵化）；茎环结构使 RNA 两端相互靠近，在 RNA 连接酶 RtcB 的作用下完成环化，形成功能性 circRNA。应用该质粒表达目标蛋白时，仅需将 Nluc 基因替换为目的基因（酶切位点为 BsiWI 和 SacII），需注意的是，为保留茎环结构的完整性，需在 SacII 的 5’端加入 GCCATGTcTATGTGG 序列。

四、参考文献

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Souce: 纽普生物    2025-12-01