一、材料和试剂 1.   正辛酸 2.  60 mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液，PBS 3.  透析袋 4.  高速低温离心机 二、操作步骤 1.  将待提取样品用60 mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液稀释3～4倍，调pH至4.5，对含脂质较高的标本可采用二氧化硅粉或玻璃纤维吸附法除去脂质...

当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分-抗原决定簇相结合。   将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，...

一、PVDF-底的免疫斑点板或者平底的酶标板 ELISpot技术要点 1.  操作BCIP/NBT显色液时最好戴上手套。 2.  为了防止边缘影响，最好在96孔扳外面包裹锡箔膜，包裹直到显色结束再弃去。 3.  加样细胞和试剂时加样枪头千万不能碰触孔底的PVDF膜，以防止损坏PVDF膜。 4.  常用的96孔扳虽然不是无菌的，但是短暂的孵育时间和培养液中抗生...

ELISPOT技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。 一、ELISPOT包被 1.  设计好实验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。 2.  每孔加入15 μL 70%的乙醇预湿30秒。 3.  加入100 μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。 4.  按照试...

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现"紫色"的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。 一、酶联免疫斑点技术（ELISPOT）简介 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了...

本方案适合于用100~1 000 bp 长的放射性标记的DNA探针对Southern转印、斑点及狭线印迹进行杂交分析。 1.  用6×SSC润湿带有固定了的DNA的膜。 2.  将膜的DNA面朝上置于杂交管中，ATP溶液的加入量为约1 ml/cm 2 膜，在68℃杂交炉中滚动3 h。 3.  在预杂交即将结束时，于100℃将DNA探针变性10 min，置于冰中...

1.  用低频率切割的不同限制性内切酶分别完全消化DNA。 2.  从每个反应取小份样品作电泳分析，用已知的分子量标准作对照。剩余的样品置于冰浴。 3.  比较分子量标准估算出DNA片段的长度，推导出每种限制性内切酶的酶切位点数目。 4.  从1的每个样品管中取少许置另外的管中，用第二种内切酶消化，电泳分析比较酶切结果。 （1）两种酶切割。 ...

利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。 目前使用的酶联免疫检测方法很多，其种类按检测目的可分为： 间接法——用于测定抗体 双抗体夹心法——主要...

具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物（即多克隆抗体）。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。 一、结果鉴定 以双相琼脂扩散试验测定所获...

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法...