一、 裂解细胞 1.  方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-80℃ 保存。（收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用） 2.  裂解细胞。采用RIPA 裂解体系，使用前40℃ 预冷，按10 7 个细胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋白酶抑制剂 （如cocktail）， 冰上放置3~5 分钟。 ...

用带正电荷的尼龙膜时，如果用碱性转移缓冲液，则转移的DNA可共价结合于膜上。 1.  印迹法中步骤1和歩骤2中所述准备凝胶及用0.25 mol/l HCl处理。 2.  用蒸馏水漂洗凝胶，并用10倍体积的0.4 mol/l NaOH变性，缓慢摇动20 min。 3.  用0.4 mol/l NaOH替代20×SSC作为转移液进行转印。转印时间≥2 h。 ...

斑点金免疫渗滤测定法是在斑点免疫渗滤测定法基础上，改用胶体金标记物代替酶，省去底物显色的步骤。试验方法是以硝酸纤维素膜（NC膜）为载体，将试剂及标本滴加在膜上，通过渗滤而逐步反应。全过程可于数分钟内完成，阳性结果在膜上呈红色斑点。 一、试剂及材料 1.  渗滤装置：为一塑料小盒（4x3x0.6 cm），分为底、盖两层，盖的中央有一个直径0.5 cm的小孔。盒底充填吸水性较强的垫料，盖孔下，紧贴垫料放置一片NC膜。紧闭...

细胞爬片免疫荧光实验步骤 第一天： 1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min； 2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min； 3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）； 4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水...

一、细胞复苏与培养 将液氮或-80℃保存的肿瘤细胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于1500 转/分, 离心3 分钟。弃上清, 再吸取8.0ml 培养基质混匀细胞沉淀, 再1500 转/分, 离心3 分钟, 弃上清, 细胞沉淀用1.0ml 培养基混匀, 备用。另取一个75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵育...

MTT法是Mosmann 1983年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。 一、经验总结 1.  首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认...

SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法，是众多免疫组织化学方法的一种。SABC法：一抗+ 生物素标记二抗+ 滴加试剂SABC（链霉卵白素+ 辣根酶标记生物素）+ 辣根酶底物显色。目前常用的亲和素从链霉菌(streptomyces)培养物中提取，因此称为链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术(streptavidin biotin-peroxidase complex metho...

1.  4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01 M KPBS清洗5 min×3后； 2.  加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80 ml+0.01 M KPBS 100 ml+30%过氧化氢）30 min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01 M  PBS清洗5 min×3； 3.  加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X10...

SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。SP法是最常使用的方法。 1.  烤片：68℃，20 min。 2.  常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：二甲苯I 20 min ⇒ 二甲苯II 20 min ⇒ 00%酒精10 min ⇒ ...

根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。 一、特点 1.  在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较SABC、SP法高。 2.  由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，...