谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的表达及纯化实验
1. 按正确读框将DNA片段亚克隆入合适的pGEX载体中,转化大肠杆菌感受态细胞, 在LB/氨苄青霉素平皿上筛选转化子,以不插入外源DNA的自连载体作对照,平皿置37℃孵育12~15 h。 2. 挑取转化菌落接种于2 ml LB/氨苄青霉素培养基,并在氨苄青霉素主平板上划线培养。同时接种含母本pGEX载体的转化菌作对照。将主平板于37℃下温育12~15 h。液体培养物则于37℃摇床中振荡培养,直至混浊。 3...
查看详情1. 按正确读框将DNA片段亚克隆入合适的pGEX载体中,转化大肠杆菌感受态细胞, 在LB/氨苄青霉素平皿上筛选转化子,以不插入外源DNA的自连载体作对照,平皿置37℃孵育12~15 h。 2. 挑取转化菌落接种于2 ml LB/氨苄青霉素培养基,并在氨苄青霉素主平板上划线培养。同时接种含母本pGEX载体的转化菌作对照。将主平板于37℃下温育12~15 h。液体培养物则于37℃摇床中振荡培养,直至混浊。 3...
查看详情第一步是分两次拉制,第一次拉长7~10mm,直径小于200μm,在此基础上进行第二次拉制,最终使尖端的直径为1~2μm,两步拉制的目的主要是使电极前端的锥度变大,狭窄部长度缩短,因此可降低电极的串联电阻,也可减少全细胞记录时的电极液透析时间。由于膜片微电极最忌沾染灰尘和脏物,更忌触碰尖端附近部位,所以一般要求在使用前制作。 第二步是在电极前端涂以硅酮树脂(sylgard),其目的是为了降低电极与灌流液之间的电容,并形成一个亲水界面。经此处理后,上述...
查看详情利用pUR载体表达lacZ融合蛋白: 1a. 按正确的读框将目的基因亚克隆入pUR载体中,转化大肠杆菌感受态细胞,在LB/氨苄青霉素平皿上挑选转化子。 2a. 接种含表达载体的单菌落于2~5 ml LB/氨苄青霉素培养基中,37℃振荡培养过夜。 3a. 取1 ml 过夜培养物加入盛于2 L 瓶中的400 ml LB/氨苄青霉素培养基中,37℃振荡培养直至OD ...
查看详情1. 进行预实验确定最佳的水解条件。准备四个反应混合物: (1)反应1:20 μg 溶解在70%甲酸中的融合蛋白。 (2)反应2:20 μg 溶解在70%甲酸/6 mol/l 盐酸胍中的融合蛋白。 (3)反应3:20 μg 溶解在13%乙酸中的融合蛋白。 (4)反应4:20 μg 溶解在13%乙酸/6 mol/l 盐酸胍中的融合蛋白。 ...
查看详情1. 进行预试验以确定最短保温反应时间。将50 μl 1 mg/ml 融合蛋白与50 μl 2×羟胺裂解缓冲液混合在1.5 ml 微量离心管中,45℃温育反应。 2. 在0、2、4、8、16和24 h 的反应时刻,分别取10 μl 反应混合物与10 μl 2×SDS样品缓冲液混匀,干冰中冻存直至所有时刻的样本收集完毕。 3. 在沸水浴中将所有样品加热10 min,加样于SDS-聚丙烯酰胺凝...
查看详情1. 进行预试验以确定最短温育反应时间。冻干两小份50 μl 的融合蛋白溶液,将其中一份重悬于5050 μl 50 mg/ml CNBr/甲酸中,另一份重悬于50 μl 含CNBr 的70%甲酸中,室温下反应。 2. 在0、8、24及48 h 的时刻,各取5 μl 并冻干。 3. 往所有冻干样本加20 μl 1×SDS样品缓冲液,煮沸10 min,加样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶。 4...
查看详情1. 做预试验监测肠激酶与融合蛋白按不同比例混合后的裂解效率,准备5个反应体系: (1)反应1至4:20 μl 融合蛋白;0.2 U、0.5 U、1 U和2 U的rEK,加50 mmol/l Tris·Cl(pH8.0)/1 mmol/l CaCl 2 至总体积30 μl。 (2)反应 5:20 μl 1 mg/ml 融合蛋白,10 μl 50 mmol/l Tris·...
查看详情1. 在20或50 ml 带球旋盖的试管中,用20倍体积含1%Triton X-100的PBS液洗涤结合在谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST融合蛋白。室温下,在台式离心机上以500 g 离心10 s 沉淀琼脂糖珠,小心弃上清,将谷胱甘肽-琼脂糖珠重悬于20倍体积的Triton X-100缓冲液中,重复洗涤1次。 2. 第二次离心后,小心弃上清,用20倍体积的GST洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽-琼脂糖珠。 3. 离心...
查看详情1. 将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl(pH7.4)/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h,或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。 2. 将样品在100倍体积的20 mmol/l Tris·Cl(pH8.0)/1 mmol/l CaCl 2 透析4 h。 3. 更换100倍体积的新鲜缓冲液重复步骤2,继续透折4...
查看详情1. 准备两个小量预试验以确定最佳裂解反应条件: (1)反应1:20 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液(在合适的缓冲液中)及0.2 μg 凝血酶。 (2)反应2:5 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液(模拟消化),25℃下温育反应。 2. 在30 min、1 h、2 h 和4 h 等时刻从反应1中分别取出5 μl 反应液与5 μl 2×SDS样品缓冲液...
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