1.  按正确读框将DNA片段亚克隆入合适的pGEX载体中，转化大肠杆菌感受态细胞， 在LB/氨苄青霉素平皿上筛选转化子，以不插入外源DNA的自连载体作对照，平皿置37℃孵育12~15 h。 2.  挑取转化菌落接种于2 ml LB/氨苄青霉素培养基，并在氨苄青霉素主平板上划线培养。同时接种含母本pGEX载体的转化菌作对照。将主平板于37℃下温育12~15 h。液体培养物则于37℃摇床中振荡培养，直至混浊。 3...

第一步是分两次拉制，第一次拉长7～10mm，直径小于200μm，在此基础上进行第二次拉制，最终使尖端的直径为1～2μm，两步拉制的目的主要是使电极前端的锥度变大，狭窄部长度缩短，因此可降低电极的串联电阻，也可减少全细胞记录时的电极液透析时间。由于膜片微电极最忌沾染灰尘和脏物，更忌触碰尖端附近部位，所以一般要求在使用前制作。 第二步是在电极前端涂以硅酮树脂（sylgard），其目的是为了降低电极与灌流液之间的电容，并形成一个亲水界面。经此处理后，上述...

利用pUR载体表达lacZ融合蛋白： 1a.  按正确的读框将目的基因亚克隆入pUR载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，在LB/氨苄青霉素平皿上挑选转化子。 2a.  接种含表达载体的单菌落于2~5 ml LB/氨苄青霉素培养基中，37℃振荡培养过夜。 3a.  取1 ml 过夜培养物加入盛于2 L 瓶中的400 ml LB/氨苄青霉素培养基中，37℃振荡培养直至OD ...

1.  进行预实验确定最佳的水解条件。准备四个反应混合物： （1）反应1：20 μg 溶解在70%甲酸中的融合蛋白。 （2）反应2：20 μg 溶解在70%甲酸/6 mol/l 盐酸胍中的融合蛋白。 （3）反应3：20 μg 溶解在13%乙酸中的融合蛋白。 （4）反应4：20 μg 溶解在13%乙酸/6 mol/l 盐酸胍中的融合蛋白。 ...

1.  进行预试验以确定最短保温反应时间。将50 μl 1 mg/ml 融合蛋白与50 μl 2×羟胺裂解缓冲液混合在1.5 ml 微量离心管中，45℃温育反应。 2.  在0、2、4、8、16和24 h 的反应时刻，分别取10 μl 反应混合物与10 μl 2×SDS样品缓冲液混匀，干冰中冻存直至所有时刻的样本收集完毕。 3.  在沸水浴中将所有样品加热10 min，加样于SDS-聚丙烯酰胺凝...

1.  进行预试验以确定最短温育反应时间。冻干两小份50 μl 的融合蛋白溶液，将其中一份重悬于5050 μl 50 mg/ml CNBr/甲酸中，另一份重悬于50 μl 含CNBr 的70%甲酸中，室温下反应。 2.  在0、8、24及48 h 的时刻，各取5 μl 并冻干。 3.  往所有冻干样本加20 μl 1×SDS样品缓冲液，煮沸10 min，加样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶。 4...

1.  做预试验监测肠激酶与融合蛋白按不同比例混合后的裂解效率，准备5个反应体系： （1）反应1至4：20 μl 融合蛋白；0.2 U、0.5 U、1 U和2 U的rEK，加50 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/1 mmol/l CaCl 2 至总体积30 μl。 （2）反应 5：20 μl 1 mg/ml 融合蛋白，10 μl 50 mmol/l Tris·...

1.  在20或50 ml 带球旋盖的试管中，用20倍体积含1%Triton X-100的PBS液洗涤结合在谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST融合蛋白。室温下，在台式离心机上以500 g 离心10 s 沉淀琼脂糖珠，小心弃上清，将谷胱甘肽-琼脂糖珠重悬于20倍体积的Triton X-100缓冲液中，重复洗涤1次。 2.  第二次离心后，小心弃上清，用20倍体积的GST洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽-琼脂糖珠。 3.  离心...

1.  将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH7.4）/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h，或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。 2.  将样品在100倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/1 mmol/l CaCl 2 透析4 h。 3.  更换100倍体积的新鲜缓冲液重复步骤2，继续透折4...

1.  准备两个小量预试验以确定最佳裂解反应条件： （1）反应1：20 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液（在合适的缓冲液中）及0.2 μg 凝血酶。 （2）反应2：5 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液（模拟消化），25℃下温育反应。 2.  在30 min、1 h、2 h 和4 h 等时刻从反应1中分别取出5 μl 反应液与5 μl 2×SDS样品缓冲液...