融合蛋白的酶解实验-辅助方案
1. 将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl(pH7.4)/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h,或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。 2. 将样品在100倍体积的20 mmol/l Tris·Cl(pH8.0)/1 mmol/l CaCl 2 透析4 h。 3. 更换100倍体积的新鲜缓冲液重复步骤2,继续透折4...
查看详情1. 将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl(pH7.4)/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h,或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。 2. 将样品在100倍体积的20 mmol/l Tris·Cl(pH8.0)/1 mmol/l CaCl 2 透析4 h。 3. 更换100倍体积的新鲜缓冲液重复步骤2,继续透折4...
查看详情1. 准备两个小量预试验反应以确定最佳温育时间: (1)反应1:20 μl 含有1 μl 200 μg/ml Xa因子的1 mg/ml 融合蛋白,室温下反应 (2)反应2:5 μl 不含因子Xa的1 mg/ml 融合蛋白(模拟消化),室温下反应。 2. 分别在2、4、8和24 h取出5 μl 反应液,加2×SDS样品缓冲液5 μl,-20℃下冻存。 3. ...
查看详情1. 将表达载体转化一种复制缺陷型的大肠杆菌cI + 溶源菌。转化物涂布于LB/抗生素平皿上并于37℃下温育。 2. 在LB/抗生素培养基中,37℃过夜培养转化细胞。 3. 以≥1:20的比例将过夜培养物稀释于新鲜的LB/抗生素培养基中。37℃,250~300 r/min 速度振荡培养至OD 650 =0.4...
查看详情1. 将表达载体转化携有温度敏感突变的抑制基因的大肠杆菌溶源菌。转化物涂布于LB/抗生素平皿上,32℃下温育。 2. 于抗生素培养基中,32℃培养转化菌。 3. 以≥1:20的比例将过夜培养物稀释往新鲜的LB/抗生素培养基中,在32℃以250~300 r/min 转速振荡培养直至OD 650 =0.6~0.8。 4. 在摇动下,加1/3体...
查看详情1. 制备从M13噬菌体mGP1-2原种,加PEG溶液沉淀浓缩噬菌体。重悬噬菌体于M9培养基,滴定其滴度。 2. 将由“基本方案”步骤1所得的含T7 启动子表达质粒转化M13许可性大肠杆菌细胞,转化物涂布于氨苄青霉素平皿上,37℃培养过夜。挑取独立转化菌落,接种于LB/氨苄青霉素培养基中,37℃温育过夜。 3. 将过夜培养物以1:100比例稀释于LB/氨苄青霉素培养基中,37℃缓缓振荡培养至OD ...
查看详情1. 将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中,转化一种标准大肠杆菌菌株,此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿,于37℃温育培养过夜。 2. 挑取独立的转化菌落于LB/氨苄青霉素培养基中,37℃培养,通过小量制备方法获得质粒DNA。以限制性酶谱分析确证基因正确插入与否。 3. 从pGP1-2转化大肠杆菌K38株涂布LB/卡那霉素...
查看详情1. 将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中,转化一种标准大肠杆菌菌株,此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿,于37℃温育培养过夜。 2. 挑取独立的转化菌落于LB/氨苄青霉素培养基中,37℃培养,通过小量制备方法获得质粒DNA。以限制性酶谱分析确证基因正确插入与否。 3. 从pGP1-2转化大肠杆菌K38株涂布LB/卡那霉素平皿上,30℃下...
查看详情1. 取血后,37℃下,让血液凝固1 到2 小时(不加抗凝剂); 2. 4℃冰箱过夜(让血块固缩); 3. 当血清自然析出后, 4℃,3000 转/分,离心10 分钟,分离血清,弃去不溶物; 4. 将血清移至一干净试管,并分装成小份,储藏在-80℃。 ...
查看详情用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多,电泳迁移率低;而RNA中以rRNA最多,占到80%~85%,tRNA及核内小分子RNA占15%~20%,mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不见的。故可通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果。 ...
查看详情1. 暗室中,以42~45℃水浴,温育盛有4盎司(113.3 g)Kodak NTB-2放射自显影胶乳瓶30 min。同时,在500 ml 三角瓶中预热等体积的水至相同温度。 2. 胶乳熔化后,缓慢沿三角瓶壁(以一角度)倒入瓶中并混匀(轻旋1~2次,防止气泡产生)。 3. 分装胶乳于尼龙闪烁瓶或塑料的玻片包装盒中。用铝箔包裹或放于闭光容器里,贮于从未存过 32 ...
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