分离纯化蛋白质，首先要从原材料中提取目的蛋白，然后通过粗分离的方法除去大量杂质，最后进行精细分离，得到目的蛋白。本实验以新型基因重组人TNF为例阐明重组蛋白TNF的提取及初步分离。   TNF的提取是将发酵菌体裂解，在一定的条件和溶液中，使被提取的TNF充分释放出来，经离心收集混合液中提取的TNF成份的过程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的杂蛋白，由于蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水分子数目，即蛋白质表面亲水基团与水分子形成水化膜的程度和带电荷的情况，当中...

离子交换色谱是将离子交换基因（CM、SP、Q、DEAE等）键合于一定的惰性载体（纤维素、交联葡聚糖，交联琼脂糖等）之上，并以此作为固定相，依据样品所带电荷的不同，从而与固定相上的离子交换基团相互作用的程度不同而进行分离的一种色谱方法。离子交换色谱技术已广泛用于蛋白质、多肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖等的纯化。   离子交换剂是在载体上键合了一些离子交换基团，而离子交换基团在水溶液中通过电离释放出游离的离子，这些离子可带正电或带负电，可以被溶液中的其它带相同电荷的离子取代，并对...

1.  剪6块3 MM 滤纸和一块NC膜。 2.  将剪好的3 MM 滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟。 3.  按下列过程安装转移装置，将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵。 4.  将3块3MM滤纸对齐放在海绵上，然后依次将NC膜、凝胶、及另3块虑纸和海绵放上。 5.  用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，NC膜一侧向正极，凝胶一...

1.  裁一张与多样过滤加样器一样大小的尼龙膜，将膜置于6×SSC的表面让其自然浸没。放置10 min。 2.  裁一张与多样过滤加样器一样大小的Whatman 3 MM 滤纸，用6×SSC浸湿。 3.  将Whatman 3 MM 滤纸置于多样抽滤加样器上，将膜放置于其上。将多样抽滤加样器按厂商说明书安装好，确保装置中不漏气。 4.  在DNA中加入20×SSC使其终浓度为6×SSC，体...

氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠，在水溶液中生成次氯酸，为一种温和氧化剂，当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中，可将I 2 氧化为I ＋ 并结合到氨基酸上。如标记条件温和，标记后的McAb仍具有良好的结合活性，通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。 1.  在细胞冻存管内加入纯化的McAb100 μg/100 μl， 再加入10 μl 0.0...

目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocynate，FITC）或罗达明（Lissamine rhodamine B200，RB200）。在碱性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 1.  将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳...

重组人α干扰素作为一种具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长及免疫调节作用的细胞因子新型药物，已在国内外广泛投入临床应用，并取得了显著的疗效。国际上对用于临床的重组干扰素的纯度要求很高，美国NIH规定必须在90 ％以上，因此生产者普遍采用亲和层析纯化法。我们研制了rHuIFN-α2a的McAb 3F1，与CNBr活化的Sepharose 4B交联制成亲和层析柱，经1年60余次较大规模试用表明具有较理想的亲和层析纯化rHuIFN-α2a的性能，达到了国内外同类McAb的水平。由于M...

根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。 1.  腹水10000 g离心10 min，除去细胞和杂质，在4 ℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40 ％饱和硫酸铵搅拌20～30 min 2.  离心，沉淀用40 ％饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（PH8.5 20 mM Tris缓冲液）透析除盐4 ℃过夜 ...

葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。 1.  用0.1 M PH8.0 磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15 min。按1 g干胶200 ml上述缓冲液充分洗涤凝胶（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤） ...

DEAE-SephadexA-50（二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为 PH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其 他蛋白则被...