一、样品提取 1.  1 ml 原核表达细胞液离心取沉淀。 2.  沉淀用100 μl IEF样品缓冲液裂解，离心取上清。 二、制胶 1.  安装超薄胶装置 2.  依次加入下述试剂 （1）胶母液  2 ml （2）尿素  8 M/脱气 （3）NP-40  0...

凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。 一、试剂与器材 ...

1.  称重后将样品加入Dounch匀浆器。每100 mg 组织加入1.5~2.0 ml SDS/或尿素/溶解缓冲液，用B号研棒冲击50次，然后以A号研棒冲击50次。 2.  放置几分钟后，取一小份样品于200 μl 离心管100 000 g 离心2 h 以上或在200 000 g 以上离心1 h。保留上清（蛋白样品）。加样于第1向凝胶上。 注意事项 在离心前，样品在SDS/溶解...

1.  用垫片组装凝胶平板。夹层每边的垫片之上用夹子固定，并置于凝胶支架上。注意玻璃平板和垫片的平齐，收紧夹子以保证密封圈不发生泄漏。调整平板的水平和垂直，在平板间将放上凝胶识别标签，使之留在右下角。 2.  在一个真空瓶中分别加入30%丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙烯酰胺，凝胶缓冲液和水，配制凝胶溶液。真空下脱气5 min。 3.  加入10%SDS和TEMED，摇匀；再加入10%过硫酸铵，摇匀。 ...

1.  在干净的1.5 mm 内径的凝胶柱管上作好标记以指示应灌制凝胶柱的髙度。用橡皮筋将凝胶柱管捆绑成束，在一水平面上垂直竖起管束，从其顶部向下推压，使各柱管的底部平齐。 2.  用三、四层Parafilm膜小心封好2.5~3.0 cm 内径的凝胶灌制管的一端，使之形成一个结实的水密性的密封面。 3.  将凝胶柱管束放入凝校灌制管内，用环形支架和夹子将灌制管固定在垂直的位置，并使其密封端置于一水平面之上。 ...

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的p...

携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 一、原核表达 1.  原核表达简介 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于...

一、操作步骤： 1. 蛋白样品制备 （1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： ① 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 ② 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 m...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相...

1.  依次加入下列试剂，建立用以标记引物的反应混合液（终体积10 μl） （1）2.5 μl  H 2 O （2）1 μl  10×T4多核苷酸激酶缓冲液 （3）1 μl  0.1 mol/l DTT （4）1 μl  1 mol/l 亚精胺 （5）1 μl  50~100 ng/μl 挂核苷酸引物 ...