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2.1.6 CsCl法从组织中提取RNA

液氮    组 织 胍 溶 液 : 590. 8 g 异 硫 氰 酸 胍 溶 于 400ul DEPC 处 理 的 水 中 ,加 人 25mmol/L Tris-Cl(pH7 .5 ). 20 ml 0. 5mol/L EDTA( pH8. 0 ) ,搅拌 过 夜 ,加水至 950ml,过滤 , 最 后 加 50 ml,β-巯基乙醇。    20%(m/V ) 十二烷基肌氨酸钠    5.7m ol/L CsCl        组 织 重 悬 液 :5 mmo/Ll EDT...

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2.1.5 CsCl法从培养细胞中提取RNA

磷酸盐缓冲溶液 (PBS)       硫氰酸胍溶液:4 mol/L 硫氰酸胍,0.lmmol/L Tris-HCl pH7.5,1%β-巯基乙醇         CsCl 5.7mol/:L (DEPC 处 理)       TES 缓冲液:0.1% SDS,10mmol/ LTris-ClpH 7.4 ,lmmol/ LEDTA         3 mmol/L 乙酸钠缓冲液 ( PH5. 2,DEPC处理)         无 水 乙 醇      经 DEFC 处理...

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2.1.3 哺乳动物细胞胞质RNA的分离

冰冷的磷酸盐缓冲液 (PBS)   137 mmol/L NaCl    2.7 mmol/ l KCl    4.3 mmol/l Na2HP04•7 H20     1.4 mmoI/L KH2PO4  pH7.3      冰冷的裂解缓冲液:50mmcil/LTris-HCl      pH 8.0  lOOmmoL/L NaCl     5 mmoL/LMgCL21)      0.5%(V/V )NkmidetP-40  1000U/ml 胎盘      RNas...

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2.1.4 卵和胚胎细胞总RNA提取

5% Triton X-100       匀浆缓冲液:50 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-Cl, ( PH7.5),  5 mmol/ L EDTA (pH 8 .0) , 0.5% SDS ,200 ug/ml  蛋甶酶 K         酚 :氯 仿(1 : 1 )      3 mol/L 乙酸钠 (pH  5.2 )。    乙醇      8 mol/L  氯化锂 1 ) 将 待 处 理 的 组 织 放 置 下...

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cDNA合成技术

cDNA第一链的合成: 1.在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl(10μg),100m mol/L甲基氢氧化汞1μl,室温反应l0分钟,使RNA变性. 2.加100m mol/l的β-巯基乙醇2μl和10m mol/l RNase抑制剂2μl,室温放置5分钟.β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用. 3.向上述反应混合物加lmg/ml的引物01igo ...

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2.1.2 哺乳动物细胞总RNA快速分离

尤钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 (PBS)      10 mmol/L  EDTA (pH8.0 )     0.5% S DS     0. lmol/L 乙酸钠(pH 5.2 )    水平衡的苯酚    乙醇   l mol/L Tris-Cl (pH8.0 )      5mol/L NaCL 1 ) 吸出培养液,用 7m l 冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 ( PBS) 冲洗细胞培养皿 内的单层细胞,重 复1 次....

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2.1.1 TRlzol试剂一步分离RNA

TRIzol 试剂是分离细胞和组织总 RNA 的即用型试剂,该试剂含有酚和硫氰酸胍单相溶液是 Chomczynsk i和 Sacchi进一步分离 RNA方法的进一步改进。在匀浆或裂解样本过程屮,TRIzol 试剂不仅可裂解细胞,而且可保持 RNA的完整。加入氯仿后离心,溶液则分为水相和有机相,RNA 绝大部分保留于水相,RNA 转到水相后,用异内醇沉淀以获的 RNA,移去水相后,样本中的DNA 和蛋白质吋用连续沉淀获得。用乙醇沉淀吋在中间相获得 DNA.异丙醇沉淀可在有机相获得蛋白...

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Hoechst染色实验

1.  用水按1:500稀释1 mg/ml 的Hoechst 染液至终浓度2 μg/ml。将稀释染液加于切片上或将玻片浸于染液中,置室温2 min。 2.  室温下,在水中洗2 min,晾干。 3.  在42℃至55℃烘箱中,烘烤玻片30~60 min,取出置室温。 4.  用0.5 g/ml 加拿大香柏油为介质,加上盖玻片,将玻片置室温干燥2天。 ...

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吉姆萨染色实验

1.  将显影的玻片置于玻片架上,浸入盛有水的染色盘中。 (1)1个盘:pH6.8 10 mmol/l 磷酸钠缓冲液,所配的25倍稀释的吉姆萨染液。 (2)3个盘:水。 (3)脱水系列溶液: ①3个盘:分别盛50%、70%和95%乙醇。 ②2个盘:盛有100%乙醇。 ③3个盘:盛有二甲苯。 ...

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冰冻切片的原位杂交实验

1.  从冰箱中取出载玻片,平衡至室温,再打开玻片盒。置载玻片于架中,浸泡于以50 mmol/l Tris·Cl(pH7.5)/5 mmol/l EDTA所配的链霉蛋白酶液中,放10 min。 2.  室温下将载玻片浸于含2 mg/ml 甘氨酸的PBS中30 s,然后再于PBS中浸2次,毎次30 s。 3.  浸载玻片于新配的TEA缓沖液中5 min。 4.  在一个烧杯中,配足量TE...

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