一、试剂配制 1 mM HEPES的配制：称取0.119 g HEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500 ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。 二、实验步骤 1.  挑取单克隆接种于2 ml YEP（含50 mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250 rpm，振荡培养过夜。（如用5 mlYEP，需培养36 h） ...

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl 2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl 2 溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。 ...

1.  E .coli 表达系统   E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。   2.  外源基因的诱导表达   提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。   ...

用GM I和GM II溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a，用改进的方法制备感受态细胞。 一、实验材料准备 1.  枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液 （1）10×Spizizen salts母液： 15% K 2 HPO 4 ·3H ...

一、试剂配制 1.  SP 盐 0.2%( NH 4 ) 2 SO 4 ，1.4% K 2 HPO 4 ，0.6% KH ...

本酵母化学感受态细胞制备试剂是一种通过化学处理，高效快速制备酿酒酵母化学感受态细胞，用于长期冻存以备后续转化的产品。 一、挑取酵母受体菌的新鲜的单菌落（4℃放置不超过3周的也可以），接种到装在50 mL 离心管中的10 mL的自备的YPD培养基中。 二、30℃摇晃培养，摇床速度250 rpm/分钟，直到OD 600 达到0.6-1.0（相当于0.6-1×10 7 ...

真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出DNA。 一、实验试剂及材料 1.  材料：幼嫩的植物材料0.5g左右。 2.  试剂：液氮，CTAB抽提缓冲液：2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵)，1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl，20mmol/...

一、参考文献 1.  Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4. 2.   Lu Y., Chanroj S....

酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和vander Ebb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。 一、传代细胞准备 ...

带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD ...