Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相...

1.  依次加入下列试剂，建立用以标记引物的反应混合液（终体积10 μl） （1）2.5 μl  H 2 O （2）1 μl  10×T4多核苷酸激酶缓冲液 （3）1 μl  0.1 mol/l DTT （4）1 μl  1 mol/l 亚精胺 （5）1 μl  50~100 ng/μl 挂核苷酸引物 ...

几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P.Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，...

一、预杂交 1.   试剂与配制 2×SSC 50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v） 预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉 2.   操作方法 （1）在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15 min； ...

免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（Protein A-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pU...

直接挑取菌落进行PCR，PCR的95℃加热可以破胞，释放基因组DNA或质粒，成为PCR体系的模板，然后进行链式扩增。 1.  PCR混合液的制备 （1）Taq buffer（10×） 180 ul （2）dNTP（2.5 mM） 20~25 ul （3）Primer Forward（引物浓度在10 Pmol） 5 ul （4）Primer Reverse（...

MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因 组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。 1.  在50 μl 体系中，DNA（2~5 μg）经NaOH（终浓度值0.2 mol/L）在37℃变性10 Min。 2.  对于ng级别的人基因组DNA，在进行修...

原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。 一、组织切片和细胞样品的制备 1.  试剂与配置 10%福尔马林；二甲苯；PBS。 2.  操作方法 （1）用1...

一、 样品RNA的抽提 1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂...

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 1．反转录酶的选择 （1） Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱...