细胞转染-磷酸钙沉淀法
酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和vander Ebb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。 一、传代细胞准备 ...
查看详情大肠杆菌感受态细胞的制备实验
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD ...
查看详情2.1.6 CsCl法从组织中提取RNA
液氮 组 织 胍 溶 液 ： 590. 8 g 异 硫 氰 酸 胍 溶 于 400ul DEPC 处 理 的 水 中 ，加 人 25mmol/L Tris-Cl(pH7 .5 ). 20 ml 0. 5mol/L EDTA( pH8. 0 ) ，搅拌 过 夜 ，加水至 950ml，过滤 , 最 后 加 50 ml，β-巯基乙醇。 20%(m/V ) 十二烷基肌氨酸钠 5.7m ol/L CsCl 组 织 重 悬 液 :5 mmo/Ll EDT...
查看详情2.1.5 CsCl法从培养细胞中提取RNA
磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 硫氰酸胍溶液：4 mol/L 硫氰酸胍，0.lmmol/L Tris-HCl pH7.5，1%β-巯基乙醇 CsCl 5.7mol/：L (DEPC 处 理） TES 缓冲液:0.1% SDS，10mmol/ LTris-ClpH 7.4 ，lmmol/ LEDTA 3 mmol/L 乙酸钠缓冲液 ( PH5. 2，DEPC处理） 无 水 乙 醇 经 DEFC 处理...
查看详情2.1.3 哺乳动物细胞胞质RNA的分离
冰冷的磷酸盐缓冲液 (PBS) 137 mmol/L NaCl 2.7 mmol/ l KCl 4.3 mmol/l Na2HP04•7 H20 1.4 mmoI/L KH2PO4 pH7.3 冰冷的裂解缓冲液：50mmcil/LTris-HCl pH 8.0 lOOmmoL/L NaCl 5 mmoL/LMgCL21) 0.5%(V/V )NkmidetP-40 1000U/ml 胎盘 RNas...
查看详情2.1.4 卵和胚胎细胞总RNA提取
5% Triton X-100 匀浆缓冲液：50 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-Cl, ( PH7.5), 5 mmol/ L EDTA (pH 8 .0) , 0.5% SDS ,200 ug/ml 蛋甶酶 K 酚 ：氯 仿(1 : 1 ) 3 mol/L 乙酸钠 (pH 5.2 )。 乙醇 8 mol/L 氯化锂 1 ) 将 待 处 理 的 组 织 放 置 下...
查看详情cDNA合成技术
cDNA第一链的合成： 1.在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg）,100m mol/L甲基氢氧化汞1μl,室温反应l0分钟,使RNA变性. 2.加100m mol/l的β-巯基乙醇2μl和10m mol/l RNase抑制剂2μl,室温放置5分钟.β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用. 3.向上述反应混合物加lmg／ml的引物01igo ...
查看详情2.1.2 哺乳动物细胞总RNA快速分离
尤钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 10 mmol/L EDTA (pH8.0 ) 0.5% S DS 0. lmol/L 乙酸钠（pH 5.2 ) 水平衡的苯酚 乙醇 l mol/L Tris-Cl (pH8.0 ) 5mol/L NaCL 1 ) 吸出培养液，用 7m l 冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 ( PBS) 冲洗细胞培养皿 内的单层细胞，重 复1 次....
查看详情2.1.1 TRlzol试剂一步分离RNA
TRIzol 试剂是分离细胞和组织总 RNA 的即用型试剂，该试剂含有酚和硫氰酸胍单相溶液是 Chomczynsk i和 Sacchi进一步分离 RNA方法的进一步改进。在匀浆或裂解样本过程屮，TRIzol 试剂不仅可裂解细胞，而且可保持 RNA的完整。加入氯仿后离心，溶液则分为水相和有机相，RNA 绝大部分保留于水相，RNA 转到水相后，用异内醇沉淀以获的 RNA，移去水相后，样本中的DNA 和蛋白质吋用连续沉淀获得。用乙醇沉淀吋在中间相获得 DNA.异丙醇沉淀可在有机相获得蛋白...
查看详情Hoechst染色实验
1. 用水按1：500稀释1 mg/ml 的Hoechst 染液至终浓度2 μg/ml。将稀释染液加于切片上或将玻片浸于染液中，置室温2 min。 2. 室温下，在水中洗2 min，晾干。 3. 在42℃至55℃烘箱中，烘烤玻片30~60 min，取出置室温。 4. 用0.5 g/ml 加拿大香柏油为介质，加上盖玻片，将玻片置室温干燥2天。 ...
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