RNA的Nouthern印迹和狭线杂交分析实验
1. 用72 ml 水溶解1 g 琼脂糖,在水浴中冷至60℃时,移至通风橱中加入10×MOPS电泳缓冲液和18 ml 12.3 mol/l 甲醛。 2. 铺制凝胶使之凝固,拔去梳子,将凝胶放进电泳池,加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1 mm 左右。 3. 将每份样品的体积用水调整至11 μl,然后加入: (1)5 μl 10×MOPS电泳缓冲液 (2...
查看详情1. 用72 ml 水溶解1 g 琼脂糖,在水浴中冷至60℃时,移至通风橱中加入10×MOPS电泳缓冲液和18 ml 12.3 mol/l 甲醛。 2. 铺制凝胶使之凝固,拔去梳子,将凝胶放进电泳池,加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1 mm 左右。 3. 将每份样品的体积用水调整至11 μl,然后加入: (1)5 μl 10×MOPS电泳缓冲液 (2...
查看详情1. 对于18 μg DNA溶液,加入10×NaOH/EDTA溶液至1×的浓度,在室温放置5 min。 2. 加入1.5倍体积的1.5 mol/l pH4.5乙酸铵缓冲液中和。 3. 加2.5倍体积乙醇-70℃沉淀15 min,离心,沉淀用70%乙醇洗涤后,在Speedvac蒸发器中干燥5 min。 4. 重溶于55 μl 水中,替代M13模板步骤3中的单链模板进行其后的操作。 ...
查看详情该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附,而在低盐下,碱基配对能力破坏,吸附解除,而其他成分的RNA则不具该特性,因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时,mRNA被挂在柱上,而其他RNA则随高盐溶液流出;当用低盐洗脱液洗柱时,mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。 1. DEPC处理层析柱。 2. 0.1 M NaOH处理Oliga(dT)-纤维素。 ...
查看详情该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附,而在低盐下,碱基配对能力破坏,吸附解除,而其他成分的RNA则不具该特性,因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时,mRNA被挂在柱上,而其他RNA则随高盐溶液流出;当用低盐洗脱液洗柱时,mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。 1. DEPC处理层析柱。 2. 0.1 M NaOH处理Oliga(dT)-纤维素。 ...
查看详情一、生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火 1. 在DEPC处理过的1.5 ml Eppendof管中,加入0.2-1 mg 的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5 ml。 2. 65℃加热10 min。 3. 加入2 μl 生物素标记的Oligo(dT)探针和12 μl 的20×SSC于RNA中轻轻混匀,室温放置,逐渐冷却平衡至室温,此步操作一般需10 m...
查看详情1. 于4℃ 12 000 g 离心从10 ml 细菌培养物回收细胞。 2. 重悬菌体于0.5 ml 裂解缓冲液,并移入微量离心管中,在干冰中冻结。 3. 解冻并用微探头超声发生器以30W超声3次,每次10 s (避免起泡),37℃温育60 min。 4. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提,于室温微量离心机高速离心5 min,上层水相移入另一干净微量离心管...
查看详情1. 培养100 ml 大肠杆菌或500 ml 蓝细菌至对数生长期,加入1/20体积终止缓冲液,置于冰上。 2. 于4℃用JA-10转子17 700 g 离心5 min 收集细胞。 3. 用2 ml STET裂解液重悬细胞,加入100 μl 0.2 mol/l 的VRC,移入15 ml 聚丙烯管子。 4. 加入1 ml 缓冲液平衡酚,振荡1 min 再加1 ml 氯仿,振荡...
查看详情1. 研钵和研棒先用液氮冷却,称出15 g 冻结植物组织于研钵中(加液氮保持冻结)。 2. 用研棒磨成粉末,立即转移到一个盛有150 ml,研磨缓冲液和50 ml TLE缓冲液平衡酚的500 ml 烧杯中。 3. 用Poltroon匀浆器,设定在5~6挡匀浆2 min,加入50 ml 氯仿,并用匀浆器在低速下混匀。 4. 将混合物移至500 ml 的Nalgene离心瓶中,于50...
查看详情1. 对于单层培奍细胞 (1)每10 cm 培养皿培养的细胞,用冰冷PBS洗涤3次。 (2)每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞,转移至冰浴的离心管中。 (3)300 g 离心5 min,弃上清,继续冰浴。 2. 对于悬浮培养细胞 (1)300 g 离心5 min,弃上请。 (2)细胞以1/2原体积的冰...
查看详情液氮研磨可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。 一、实验试剂准备 1. RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),...
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