酵母菌RNA制备实验-备选方案1(玻璃珠法)
1. 培养并收集酵母菌细胞,冷冻细胞沉淀。 2. 用300 μl RNA缓冲液中重悬细胞沉淀。 3. 加1体积冷的酸洗玻璃珠(体积与约200 μl 水相等)、300 μl 的用RNA缓冲液平衡的25:24 :1酚/氯仿/异戊醇,拧紧瓶盖,然后颠倒并上下振荡以保证珠子悬浮,在旋涡混合器上高速剧烈振荡2 min。 4. 室温下离心1 min,将200~250 μl 水(上)相转移到...
查看详情1. 培养并收集酵母菌细胞,冷冻细胞沉淀。 2. 用300 μl RNA缓冲液中重悬细胞沉淀。 3. 加1体积冷的酸洗玻璃珠(体积与约200 μl 水相等)、300 μl 的用RNA缓冲液平衡的25:24 :1酚/氯仿/异戊醇,拧紧瓶盖,然后颠倒并上下振荡以保证珠子悬浮,在旋涡混合器上高速剧烈振荡2 min。 4. 室温下离心1 min,将200~250 μl 水(上)相转移到...
查看详情1. 酵母细胞在10 ml 培养基中生长至指数中期(OD 600 =1.0)。 2. 将培养液转移到50 ml,离心管,于4℃,1 500 g 离心3 min。 3. 弃上清,菌体沉淀用1 ml 冰冷的水重悬,转移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中, 4℃离心10 s,弃上清,继续步骤4。需要时,将离心管置于干冰上速冻。 4. 用400 μ...
查看详情白色葡萄球菌琼脂平板培养物,大肠杆菌和痢疾杆菌半固体培养物,大肠杆菌斜面培养物,金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、链球菌肉汤培养物。 1、在液体培养基中的生长表现: (1)混浊生长:液体均匀混浊,或有少量沉淀。大多细菌如此。 (2)沉淀生长:液体清晰,细菌主要集中在管底形成沉淀。链球菌如此。 (3)表面生长:液体清晰,细菌主要生长在液面形成菌膜。专性需氧菌如此。 ...
查看详情1. 在18 mm×150 mm 无菌玻璃培养管或17 mm×100 mm 无菌聚丙烯酰胺管中用10 ml YPD培养基过夜培养酵母菌至静止期。 2. 培养物室温下在台式离心机上1 200 g 离心5 min,吸出或倒掉上清,细胞用0.5 ml水重悬。 3. 将重悬细胞转移至离心管中,室温下离心5 s,倒掉上清,在旋涡混合器上快速振荡分散菌体沉淀。 4. 细胞用200 μl 破菌缓沖...
查看详情1. 注盛于一个13 mm×100 mm 无菌玻璃试管中的2 ml 培养基接种含有带目的基因的质粒的酵母单菌落,在转动或摇动培养箱中30℃过夜培养到静止期。 2. 将1.5 ml 的过夜培养物转移到微量离心管中,室温高速离心5 s,倒掉上清,快速振荡分散沉淀物。 3. 细胞用200 μl 破菌缓冲液重悬,加0.3 g 玻璃珠(约200 μl 体积)及200 μl 酚/氯仿/异戊醇,在漩涡混合器上高速...
查看详情1. 构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株,及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。 2. 将必需基因亚克隆到YCp载体(带有URA3以外的选择标志),取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。 3. 转化至步骤1的菌株中,在添加了尿嘧啶的省却成分平极上,选择YCp质粒,于允许温度下培养(通常为25℃)。 4. 将每一个转化平板影印到两个带有5-...
查看详情1. 将目的基因亚克隆到YRp质粒,通过基因内的两个限制性位点在基因中创造一个缺口区,在缺口两侧留下≥100~250 bp 的同源区,凝胶电泳纯化质粒骨架大片段。 2. 用1~10 μg 缺口质粒DNA转化待拯救的含突变等位基因的酵母菌株,通过YRp质粒上的选择基因进行选择,应用质粒分离除去技术鉴定选择标志不稳定的转化子。 3. 在不稳定的转化子中,筛选那些仍然显示突变表型的转化子。 4. ...
查看详情一、整合性破坏 1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。 2. 在此内部片段中将质粒线性化。 3. 继续整合性转化步骤3(见基本方案1)。 二、基因破坏一步法 1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上,必要时,可在亚克隆的同时引入一个缺失。 2. 采用合适的限制性位点,从步骤1抅建的质粒中...
查看详情1. 将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。 2. 用限制性内切酶在克隆化基因内部切开,使质粒线性化。 3. 用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株,通过质粒上带的标记进行选择,在选择培养基上纯化几个转化子,制备DNA,应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期望的位点,并且测定是否发生了多重整合。 注意事项 如果没有单限制性酶切位点,可以在此区域...
查看详情G+菌细胞壁肽聚糖含量多,结构致密,脂质少,乙醇不易渗入脱色;G-菌细胞壁肽聚糖含量少,结构疏松,脂质多,乙醇容易溶解脂质而渗入脱色。G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐,能与结晶紫、碘牢固结合,使乙醇不易将其脱色;G-菌菌体核糖核酸镁盐含量少,容易被乙醇脱色。G+菌等电点比G-菌低,在同样PH值条件下比G-菌所带负电荷多,容易与带正电荷的碱性染料(结晶紫),故不易被乙醇脱色。 1. 制备标本片 (1)取干净载玻片1块,用记号笔划分为2个区...
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