1.  培养并收集酵母菌细胞，冷冻细胞沉淀。 2.  用300 μl RNA缓冲液中重悬细胞沉淀。 3.  加1体积冷的酸洗玻璃珠（体积与约200 μl 水相等）、300 μl 的用RNA缓冲液平衡的25：24 ：1酚/氯仿/异戊醇，拧紧瓶盖，然后颠倒并上下振荡以保证珠子悬浮，在旋涡混合器上高速剧烈振荡2 min。 4.  室温下离心1 min，将200~250 μl 水（上）相转移到...

1.  酵母细胞在10 ml 培养基中生长至指数中期（OD 600 =1.0）。 2.  将培养液转移到50 ml，离心管，于4℃，1 500 g 离心3 min。 3.  弃上清，菌体沉淀用1 ml 冰冷的水重悬，转移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中， 4℃离心10 s，弃上清，继续步骤4。需要时，将离心管置于干冰上速冻。 4.  用400 μ...

白色葡萄球菌琼脂平板培养物，大肠杆菌和痢疾杆菌半固体培养物，大肠杆菌斜面培养物，金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、链球菌肉汤培养物。 1、在液体培养基中的生长表现： （1）混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。大多细菌如此。 （2）沉淀生长：液体清晰，细菌主要集中在管底形成沉淀。链球菌如此。 （3）表面生长：液体清晰，细菌主要生长在液面形成菌膜。专性需氧菌如此。 ...

1.  在18 mm×150 mm 无菌玻璃培养管或17 mm×100 mm 无菌聚丙烯酰胺管中用10 ml YPD培养基过夜培养酵母菌至静止期。 2.  培养物室温下在台式离心机上1 200 g 离心5 min，吸出或倒掉上清，细胞用0.5 ml水重悬。 3.  将重悬细胞转移至离心管中，室温下离心5 s，倒掉上清，在旋涡混合器上快速振荡分散菌体沉淀。 4.  细胞用200 μl 破菌缓沖...

1.  注盛于一个13 mm×100 mm 无菌玻璃试管中的2 ml 培养基接种含有带目的基因的质粒的酵母单菌落，在转动或摇动培养箱中30℃过夜培养到静止期。 2.  将1.5 ml 的过夜培养物转移到微量离心管中，室温高速离心5 s，倒掉上清，快速振荡分散沉淀物。 3.  细胞用200 μl 破菌缓冲液重悬，加0.3 g 玻璃珠（约200 μl 体积）及200 μl 酚/氯仿/异戊醇，在漩涡混合器上高速...

1.  构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。 2.  将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。 3.  转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平极上，选择YCp质粒，于允许温度下培养（通常为25℃）。 4.  将每一个转化平板影印到两个带有5-...

1.  将目的基因亚克隆到YRp质粒，通过基因内的两个限制性位点在基因中创造一个缺口区，在缺口两侧留下≥100~250 bp 的同源区，凝胶电泳纯化质粒骨架大片段。 2.  用1~10 μg 缺口质粒DNA转化待拯救的含突变等位基因的酵母菌株，通过YRp质粒上的选择基因进行选择，应用质粒分离除去技术鉴定选择标志不稳定的转化子。 3.  在不稳定的转化子中，筛选那些仍然显示突变表型的转化子。 4. ...

一、整合性破坏 1.  将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。 2.  在此内部片段中将质粒线性化。 3.  继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。 二、基因破坏一步法 1.  将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。 2.  采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中...

1.  将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。 2.  用限制性内切酶在克隆化基因内部切开，使质粒线性化。 3.  用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株，通过质粒上带的标记进行选择，在选择培养基上纯化几个转化子，制备DNA，应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期望的位点，并且测定是否发生了多重整合。 注意事项 如果没有单限制性酶切位点，可以在此区域...

G＋菌细胞壁肽聚糖含量多，结构致密，脂质少，乙醇不易渗入脱色；G－菌细胞壁肽聚糖含量少，结构疏松，脂质多，乙醇容易溶解脂质而渗入脱色。G＋菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，能与结晶紫、碘牢固结合，使乙醇不易将其脱色；G－菌菌体核糖核酸镁盐含量少，容易被乙醇脱色。G＋菌等电点比G－菌低，在同样PH值条件下比G－菌所带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料（结晶紫），故不易被乙醇脱色。 1. 制备标本片 （1）取干净载玻片1块，用记号笔划分为2个区...