1.  酵母细胞在10 ml 培养基中生长至指数中期（OD 600 =1.0）。 2.  将培养液转移到50 ml，离心管，于4℃，1 500 g 离心3 min。 3.  弃上清，菌体沉淀用1 ml 冰冷的水重悬，转移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中， 4℃离心10 s，弃上清，继续步骤4。需要时，将离心管置于干冰上速冻。 4.  用400 μ...

白色葡萄球菌琼脂平板培养物，大肠杆菌和痢疾杆菌半固体培养物，大肠杆菌斜面培养物，金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、链球菌肉汤培养物。 1、在液体培养基中的生长表现： （1）混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。大多细菌如此。 （2）沉淀生长：液体清晰，细菌主要集中在管底形成沉淀。链球菌如此。 （3）表面生长：液体清晰，细菌主要生长在液面形成菌膜。专性需氧菌如此。 ...

1.  在18 mm×150 mm 无菌玻璃培养管或17 mm×100 mm 无菌聚丙烯酰胺管中用10 ml YPD培养基过夜培养酵母菌至静止期。 2.  培养物室温下在台式离心机上1 200 g 离心5 min，吸出或倒掉上清，细胞用0.5 ml水重悬。 3.  将重悬细胞转移至离心管中，室温下离心5 s，倒掉上清，在旋涡混合器上快速振荡分散菌体沉淀。 4.  细胞用200 μl 破菌缓沖...

1.  注盛于一个13 mm×100 mm 无菌玻璃试管中的2 ml 培养基接种含有带目的基因的质粒的酵母单菌落，在转动或摇动培养箱中30℃过夜培养到静止期。 2.  将1.5 ml 的过夜培养物转移到微量离心管中，室温高速离心5 s，倒掉上清，快速振荡分散沉淀物。 3.  细胞用200 μl 破菌缓冲液重悬，加0.3 g 玻璃珠（约200 μl 体积）及200 μl 酚/氯仿/异戊醇，在漩涡混合器上高速...

1.  构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。 2.  将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。 3.  转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平极上，选择YCp质粒，于允许温度下培养（通常为25℃）。 4.  将每一个转化平板影印到两个带有5-...

1.  将目的基因亚克隆到YRp质粒，通过基因内的两个限制性位点在基因中创造一个缺口区，在缺口两侧留下≥100~250 bp 的同源区，凝胶电泳纯化质粒骨架大片段。 2.  用1~10 μg 缺口质粒DNA转化待拯救的含突变等位基因的酵母菌株，通过YRp质粒上的选择基因进行选择，应用质粒分离除去技术鉴定选择标志不稳定的转化子。 3.  在不稳定的转化子中，筛选那些仍然显示突变表型的转化子。 4. ...

一、整合性破坏 1.  将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。 2.  在此内部片段中将质粒线性化。 3.  继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。 二、基因破坏一步法 1.  将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。 2.  采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中...

1.  将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。 2.  用限制性内切酶在克隆化基因内部切开，使质粒线性化。 3.  用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株，通过质粒上带的标记进行选择，在选择培养基上纯化几个转化子，制备DNA，应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期望的位点，并且测定是否发生了多重整合。 注意事项 如果没有单限制性酶切位点，可以在此区域...

G＋菌细胞壁肽聚糖含量多，结构致密，脂质少，乙醇不易渗入脱色；G－菌细胞壁肽聚糖含量少，结构疏松，脂质多，乙醇容易溶解脂质而渗入脱色。G＋菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，能与结晶紫、碘牢固结合，使乙醇不易将其脱色；G－菌菌体核糖核酸镁盐含量少，容易被乙醇脱色。G＋菌等电点比G－菌低，在同样PH值条件下比G－菌所带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料（结晶紫），故不易被乙醇脱色。 1. 制备标本片 （1）取干净载玻片1块，用记号笔划分为2个区...

1.  挑取几个含质粒的酵母宿主菌菌落，接种于10 ml 非选择性培养基，于30℃培养过夜。 2.  在非选择性平板上于30℃培养2天以得到单菌落，大多数情况下，可以得到约200~300个单菌落（约每平板100个菌落）。 3.  通过影印到选择性平板上以确定丢失了质粒选择标志的菌落，于30℃培养过夜，那些可在主平板上生长的但不能在选择性平板上生长的菌落丢失了质粒。 注意事项 ...