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DNA片段探针的应用实验-甲酰胺法

1.  用5~20 ml 杂交液Ⅰ依次浸泡10~20张硝酸纤维素滤膜。滤膜装入杂交袋中,加入足够的杂交液,密封后42℃预杂交1 h。 2.  往带螺盖的试管中,加入放射性探针和2 mg 超声波处理的鲱鱼精DNA,煮沸10 min。 3.  探针混合液移至冰浴,加入2 ml 杂交液Ⅰ 。 4.  用带18-G针头的注射器将探针混合液加入到杂交袋中滤膜上,重新密封后于42℃温育过夜。 ...

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细菌形态学检查实验-芽胞染色法

芽胞(Spore)是细菌的休眠状态,对各种理化因素有强大的抵抗力,能耐受恶劣环境的影响。芽胞折光性很强,可经特殊染色法染色后,在光学显微镜下观察。本实验要求学生了解两种特殊染色法并认识这种细菌特殊构造。 一、威-康(Wiltz-Conkln)二氏芽胞染色法 1.  材料 破伤风杆菌(Clostridium tetani)24 h琼脂斜面纯培养物, 3%孔雀绿水溶液, 0.5%花红水溶液, ...

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细菌形态学检查实验-荚膜染色法

细菌的荚膜(Capsule)具有保护细菌抵抗吞噬和消化的作用,可增加细菌的侵袭力。荚膜不易被普通染色法染色,需经特殊染色法染色后才能着色,易于观察。 一、材料 经腹腔接种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)后死亡的小白鼠, 结晶紫染液,20%硫酸铜溶液, 解剖器材, 滤纸片。 二、方法 1.  涂片 解剖小白...

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微生物污染的排除实验-动物体内接种除菌法

把受支原体污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔中,借动物免疫系统消灭支原体,而肿瘤细胞却能在体内继续生长,待—定时间后,从体内取出细胞再进行培养繁殖。但此法稍繁琐,按同一原理也可在体外进行。 ...

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微生物污染的排除实验-巨噬细胞吞噬法

从动物腹腔采取巨噬细胞,为排除其它细胞成分。可先进行纯化。然后再加入被支 原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中,为检验支原体是否已被消除干净, 可利用支持物培养法验证;取出支持物逐日染色、镜检观察,至支原体已被 消除干净为止。 注意事项 巨噬细胞不纯化亦可,但难免混杂有少许间皮细胞,这些细胞因量少,一般难持久生存,最终与巨噬细胞均死亡,对培养细胞...

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微生物污染的排除实验-加温除菌法

根据支原体对热耐受性差的特点,有人把受污染的细胞置41 ℃中作用5~10 小时, 最长可达18 小时,以杀灭支原体。 注意事项 但41 ℃对培养细胞本身也有很大影响,故在处理前, 应先进行预试验,确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的最佳处理时间;加温 处理很难避免不伤害细胞,是其不足。 ...

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质粒的转化及转化子的鉴定实验-电转化法

电转化法:外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定,形成电穿孔,不仅有利于离子和水进入细菌细胞,也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 1.  l ml X-gal (20 mg/ml),25 ml Amp(100 mg/ml),250 ml 制备选择性培养基平板:在融化的250 ml LA培养基中250 mI PTG (200mg/ml),混匀后倒入灭菌培养皿中; ...

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粘粒及质粒文库的铺平板和转移实验

1.  在含抗生素的平板上,通过系列等比稀释确定质粒和粘粒文库的滴度,计算出最佳的铺平板用的细菌悬液量并稀释到5~10 ml LB培奍基中。 2.  准备一层无菌的10 cm 或15 cm的Whatman 3 MM 滤纸,故在玻璃布氏漏斗或瓷质过滤漏斗中,加入10~20 ml LB培养基。 3.  将标记好方向的硝酸纤维素滤膜放入含抗生素的LB平板中,并移至过滤装置,再将细菌悬液用吸管加到滤膜上,注意不要往滤膜边缘4...

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质粒的转化及转化子的鉴定实验-热激法

热激法:大肠杆菌在0 ℃ CaCl 2 低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42 ℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中,重组子基因得到表达,在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 1.  l ml X-gal (20 mg/ml),25 ml Amp(10...

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质粒的制备实验

在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 1.   取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养...

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