1.  将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。 2.  用限制性内切酶在克隆化基因内部切开，使质粒线性化。 3.  用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株，通过质粒上带的标记进行选择，在选择培养基上纯化几个转化子，制备DNA，应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期望的位点，并且测定是否发生了多重整合。 注意事项 如果没有单限制性酶切位点，可以在此区域...

G＋菌细胞壁肽聚糖含量多，结构致密，脂质少，乙醇不易渗入脱色；G－菌细胞壁肽聚糖含量少，结构疏松，脂质多，乙醇容易溶解脂质而渗入脱色。G＋菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，能与结晶紫、碘牢固结合，使乙醇不易将其脱色；G－菌菌体核糖核酸镁盐含量少，容易被乙醇脱色。G＋菌等电点比G－菌低，在同样PH值条件下比G－菌所带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料（结晶紫），故不易被乙醇脱色。 1. 制备标本片 （1）取干净载玻片1块，用记号笔划分为2个区...

1.  挑取几个含质粒的酵母宿主菌菌落，接种于10 ml 非选择性培养基，于30℃培养过夜。 2.  在非选择性平板上于30℃培养2天以得到单菌落，大多数情况下，可以得到约200~300个单菌落（约每平板100个菌落）。 3.  通过影印到选择性平板上以确定丢失了质粒选择标志的菌落，于30℃培养过夜，那些可在主平板上生长的但不能在选择性平板上生长的菌落丢失了质粒。 注意事项 ...

1.  用含LEU 2作为选择标志的酵母菌DNA文库转化lea 2 cdc 101-1酵母菌株，在23℃培养，依据插入片段的大小，筛选2 000~20 000个Leu + 转化体。 2.  影印平板转化体，将其转印到预热的选择性平板，并于37℃培养筛选互补温感突变的表型。过夜培养之后，含插入互补cdc 101-1突变基因片段的质粒的菌落以及含随机非互补质粒的潜在CDC 101 ...

1.  将DNA溶于pH8.0的1×TE缓冲液，终浓度为10 mg/ml。于4℃搅拌过夜。 2.  用一个大的超声探头，在75%的满功率下超声处理DNA 30 s，以降低DNA溶液的粘度。取1 μg DNA在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检查超声剪切后片段大小的分布。如有必要，可重复超声处理，直到获得适当的片段大小分布。片段大小范围在2~15 kb 之间，平均大小约为7 kb 是合适的。 3.  用缓冲液平衡酚抽提...

1.  实验前两天，将转化用酵母菌株的单菌落接种于5 ml YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和。 2.  转化前一天晚上，在装有500 ml YPD培养基的2 L 无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30℃剧烈摇动培养过夜，直到细胞密度达1×10 8 细胞/ml（OD600≈1.3~1.5，依据菌株不同而异）。 3.  于4℃以4 000 g 离心收获培养...

1.  在实验前2天，将转化用酵母菌株的单菌落接种到5 ml YPD培养基中，于30℃培养过夜（如果酵母菌株是温度敏感的应在低温下培养）。 2.  转化前一天晚上，从5 ml 过夜培养液中取适量的菌液，接种于盛有50 ml YPD培养基的250 ml 无菌烧瓶中，再过夜培养，使细胞密度达到1~2×10 7 细胞/ml（OD 600 =...

1.  在开始实验前2天，接种待转化的酵母菌株的单菌落于5 ml YPD培养基中，于30℃恒温摇床，培养过夜。 2.  转化的前一天晚上，往1 L 无菌烧瓶中加入300 ml YPAD培养基，然后接种适量的过夜培养液，再于30℃培养过夜，到细胞密度为1×10 7 细胞/ml （OD 600 ≈0.3~0.5，依据菌株而定）， 为了获得2~3倍高的转化效...

1.  制备双份的转印细菌菌落或噬斑的硝酸纤维素滤膜（处理和干烤过）。 2.  在室温下用3× SDS / 0.1%SDS溶液500 ml 洗膜3~5次。 3.  然后在65℃洗膜至少1.5 h 以上直至过夜。 4.  在预杂交液中37℃预杂交1 h。 5.  在装有20 ml 以上的SSC杂交液的可封口的杂交袋中可移入多达20张的滤膜。 ...

1.  将过夜培养的酵母菌培养液接种到5 ml YPD培养基中，于30℃培养。离心5~10 s，用1 ml 无菌水重悬沉淀细胞，重复洗涤1次，再用1 ml 无菌水重悬。 2.  检查细胞密度，记录数据后将细胞密度调整到2×10 8 细胞/ml。用无菌水系列稀释细胞悬液，最终确定在平板上生长出100~200个菌落的稀释度。在平板上分别涂布0.1 ml 和0.2 ml 释的菌悬液。 ...