观察阿霉素（Doxorubicin，DOX）单用或与RAPA联合用药对HepG2和Hep3B细胞生物学行为及PI3K/Akt/mTOR信号通路活性的影响，探讨mTOR抑制剂增强HCC化疗药物疗效的相关作用机制。 一、细胞表达检测 1.  分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞，以不同浓度的DOX单用或与RAPA（20 nmol/ml）联合应用培养48 h或24h。 2.  以MTT...

一、操作要领 1.  混匀操作要领 （1）火焰消毒吸管，用Hanks液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。 （2）吸管头插入管底。 （3）用吸管反复轻轻吹打组织块。 2.  器械的使用 （1）用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。 （2）器械置无菌干纱布内嚓一下。迅速通...

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。 一、实验材料准备 ...

将小鼠的成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 一、取得小鼠胚胎 1. 性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。 2. 每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。 ...

一.准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 二.流程： 1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2.在空中加入约5X10 5 个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满...

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV是一种Ca依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴...

经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。 流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。...

其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1.  细胞核的改变 由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞...

1. 酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。 2. 在离心管中加入如下成分： 10×Buffer　  1μl 待切样品　　　xμl 酶　　　　　　0.5-1μl ———————————— 加水补足10μl 3. 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。 4. 将...

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 一、冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷...