用标记的 M13 mp9 DNA 与 Southern 印迹后的细胞 DNA 杂交，严格冲洗后，通过放射自显影技术，观察与 M13 序列结合的DNA 片段分布图谱 [ Westneat et al.，1988 ] 。 1. 在聚乙烯三明治盒中，把膜（最多三张膜）放入 200 ml 55°C 预热预杂交液（0.263 mol/L 磷酸氢二钠；7 % （W /V）SDS，1 mmol/L EDTA，1 % （W / V）BSA 片段 V （Roche））中。 ...

用随机引物延伸法标记 M13mp9 DNA [ Finberg and Voglstein，1983 ]，并用葡聚糖柱（Sephadex） 纯化。 1. 在无菌小管中，将 2 μl 稀释的 M 13 DNA （0.25 ng/μl Boehringer Mannheim，以 1:4稀释于蒸馏水中）和 11 μl 蒸馏水混匀。 2. 将小管置于沸水浴 2 min。 3. 直接将小管放入冰中 5 min。 ...

细胞中提取的 DNA 经限制性酶消化，利用 Southern 印迹技术将消化产物固定在尼龙膜上 [ Ausubel etal.，1996，2002 ]，与来自 M 13 噬菌体的标记 DNA 进行杂交。 1. 约10 7 个细胞（用细胞刮或胰蛋白酶消化收集）用 D-PBSA （不含 Ca 2+ 和 Mg 2+ 的磷酸盐缓冲液...

打开显微镜，校准光路。在标本有关区域聚焦。检査相机与电脑的连接，将光导向相机，聚焦，保存图像。 1. 准备照相用的培养物（确保培养物没有碎片一如在照相前更换原代培养液） (a)培养瓶培养 i)将培养瓶拿到超净台中，松开瓶盖，冷却培养物。 ii)当培养物温度为室温时，盖紧瓶盖。可避免冷却引起的变形。 iii)转动培养液冲洗培养瓶顶部的内面，移除可能形成的冷凝物...

1. 吸去并弃掉培养基。 2. 用 D-PBSA 冲洗单层细胞，弃掉冲洗液。 3. 每 25 cm 2 加入 D-PBSA / 甲醇 5 ml，静置 2 min，弃掉 D-PBSA / 甲醇。 4. 加入新甲醇 5 ml，静置 10 min。 5. 弃掉甲醇，将培养皿倒干净，使其干燥。 6. 每 25...

培养物用甲醇固定，直接用未稀释的 Giemsa 液进行染色，然后1：10 稀释染液，清洗培养物，在潮湿状态下观察。 本程序假设用单层细胞进行染色，而固定的悬浮细胞也可以使用，但从第6 步开始。 1. 移除培养基。 2. 用 D-PBSA 冲洗单层细胞，去掉冲洗液。 3. 加 D-PBSA / 甲醇液 5 ml/25 cm 2 ，静置 2 ...

将培养物放在显微镜的载物台上，打开电源，选择合适的镜头，聚焦于标本。如果必要的话，将聚光器和相差环调节在中心。 1. 确保显微镜（配有相差10×、20× 或40× 的物镜及聚光器和合适的相差环）洁净（用 70 % 乙醇擦拭载物台。如果有必要，用擦镜纸清洁物镜）。 2. 打开电源，将灯光强度从最低开始调至合适的强度，而不是直接打到强光。 3. 检查光源与聚光器的衔接： (a)将一张染色...

这种方法可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒DNA。但它需要使用溴化乙锭，并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。 1.  粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中，加入4.4 g CsCl，溶解后，再加入0.4 ml 10 mg/ml 溴化乙锭。 2.   将溶液转入一个5 ml 的quick-seal快速封口的超离心管中。 3.  酌情往管中加入CsCl/TE溶液...

细胞层（buffy coat）或另一种混合细胞悬液同与抗体连接的微珠混合，稀释后放人一个磁性分离柱中。与微珠结合的细胞会贴到柱子的侧壁上，而未结合磁珠的细胞则流过柱子。将分离柱从磁场移开，结合微珠的细胞就从柱子上释放，用针栓从柱中收集。 一、标记 1. 标准方法分离外周血单核细胞或经酶消化法及其他方法制备的细胞悬液。 2. 用 Ficoll-Paque 去除死细胞。 3. 用...

将细胞依次置于浓度逐渐增加的叶酸拮抗剂中，如氨甲蝶呤（MTX ) 中，经过一段时间，细胞会产生对药物毒性的抵抗 [ Biedler et al，1972 ]，这是 DHFR 基因扩增的结果，这种抗性通常产生得非常快，当然可能还有其他机制部分或全部参与到抗性表型的形成中，比如，抗叶酸转运方面的改变和（或）突变影响酶结构或亲和力。 1. 克隆培养亲代细胞形成生长旺盛、基因型一致的细胞群体，用于筛选。 2. 用无菌 NaCl 0.15 mo...