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酶与抗体的偶联实验-备选方案

1.  透析5 mg/ml 抗体溶液,除使用PBS之外,其方法与基本方案中的步骤1完全相同。透析完毕,将抗体溶液置于一个试管中,并测A 280 处吸光度。用PBS将其稀释至3 mg/ml。 2.  往一个1. 5 ml 的微量离心管中加入3 mg/ml 的抗体溶液100 碱性磷酸酶90 μl。再加入5 μl 的25%戊...

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单克隆抗体上清的制备实验-基本方案1

1.  将杂文瘤置于一个盛有完全DMEM-10培养基的175 cm 2 组织培养瓶中,置37 ℃CO 2 培养箱中,直至生长旺盛适于分传。 2.  按1:10的比例将细胞分传到一个新的175 cm 2 的培养瓶中,加入完全DMEM-10培养液到总液量为100 ml,并置CO ...

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单克隆抗体上清的制备实验-备选方案2

1.  同备择方案1中大规模制备MAb上清的步骤1~4,但等细胞长到合适的密度时就应收获细胞,或者是在细胞生长的平台期收获。 2.  将细胞倒入无菌的250 ml 锥形离心管中,于4℃ 250 g 离心15 min,弃上清。 3.  置细胞沉淀于冰上,重悬细胞于4℃250 ml 的PBS,于4℃250 g 离心,弃上清。 4.  重复以上步骤,最终把细胞合并到一管中,细胞经过3次冼涤后,可...

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单克隆抗体的腹水制备实验

1.  用20G或22G的注射针,小鼠腹膜内注射降植烷,每只鼠0.5 ~ 1 ml,1周后接种细胞。 2.  在175 cm 2 培养瓶中加完全DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养液,进行杂交瘤细胞的培养,使细胞生长至对数期。 3.  将培养液转入50 ml 锥形离心管中,室温下500 g 离心5 min。 4.  细胞重悬于50 ml 无菌的PB...

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单克隆抗体的纯化实验-基本方案

1.  将蛋白A-Sepharose置于Tris缓冲液中(超过50倍的量,v/v)充分溶胀。在室温下将其灌入直径为2.5 cm 玻璃层析柱中,用Tris缓冲液使其平衡。 2.  腹水浓稀释于3倍体积的Tris缓冲液,以1~5 ml/min 的速度上样于蛋白A-Sepharose柱,用Tris缓冲液洗柱子直至所有的未结合的蛋白都被洗脱,采用A 280 监测。 ...

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单克隆抗体的纯化实验-备选方案

1.  将10 ml 经CNBr活化Sepharose 4B溶胀于1 mmol/l HCl中,然后转移至玻璃沙漏斗中,并用:①200~500 的1 mmol/l HCl和②200~500 ml 偶联缓冲液各连续洗涤不少于30 min。 2.  将Sepharose凝胶转移至50 ml 锥形塑料离心管中,加50~100 mg 的配体,混匀后4℃静置过夜。 3.  250 g 离心10 min,弃上清,加偶联缓冲液至...

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兔多克隆抗血清的制备实验-基本方案(肌肉内注射免疫法)

1.  取2 ml 的弗氏完全佐剂加到2 ml 的溶于PBS的纯化抗原中,使之乳化。用3 ml 注射器抽取此乳化液,接上22G注射针头,排出注射器中的气泡。 2.  将兔子敢在固定架上,用一只手抓住兔的颈背部毛皮,另一只手托住兔的后腿及臀部,将兔束紧固定以使后肢不能伸张,用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒,在后肢大腿肌肉内进针约1 cm 深,毎条大腿肌肉内最多注射0.5 ml 乳化液。 3.  四周后,用1 ...

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大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段实验-随即寡核苷酸引物介导

此法是一种用以产生高放射比活、放射标记均匀分布的04八片段的切口平移方法。 1.  用合适的限制性内切酶消化DNA,DNA片段经电泳纯化或乙醇沉淀,用TE缓冲液重悬。 2.  在冰浴中混合下列物质: (1)2.5 μl 0.5mmol/l  3dNTP混合液 (2)2.5 μl  10×klenow酶缓冲液 (3)5 μl  3000Ci/mmol...

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兔多克隆抗血清的制备实验-备选方案1(皮内注射免疫法)

1.  按基本方案中步骤1制备免疫兔用的抗原。 2.  牢牢地抓住兔子,剃除其背毛,用70%乙酵消毒其暴露的皮肤。用拇指和食指将需要免疫注射的区域的皮肤张开,用3 ml 注射器带24G注射针头以相对皮肤30 。 的角度进针(针尖的斜面朝上),进针深度只达外皮层之下。放低注射器,使之平放在兔的背部上,将≤100 μl 的乳化抗原注射进真皮层间,与前操作相同,分别在兔的背部选择其他4个部位,并注射不大于...

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