细胞分离纯化技术-Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20 mosm/kg H 2 O), 粘度也很小,可形成高达1.3 g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心 力(200~1000 g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数 低,所形成的梯度十分稳定。此外,Percoll不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广 ...
查看详情Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20 mosm/kg H 2 O), 粘度也很小,可形成高达1.3 g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心 力(200~1000 g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数 低,所形成的梯度十分稳定。此外,Percoll不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广 ...
查看详情1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。 一、细胞融合前准备 ...
查看详情1. 标记和洗涤细胞(温和去污裂解法,步骤1~7)。 2a. 对于贴壁细胞:加入适量SDS裂解液至培养皿中。(35 mm 培养皿加0.1 ml,50 mm 培养皿0.25 ml,100 ml 培养皿0.5 ml)立即用橡皮细胞刮于刮下细胞并转移至带螺口盖的微量离心管中。 2b. 对于非贴壁细胞:在旋涡混合器上短暂振荡细胞沉淀使之松散,加入1 ml SDS裂解缓冲液(毎5×10 7...
查看详情1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。 对于贴壁细胞: 2a. 吸去培养液,用37℃的含血清不加标记物的标记培养液洗尽残存的含磷酸盐培养液,吸尽该培养液。 3a. 加入预热的标记培养液,加入量为:0.5~1 ml/35 mm 培养皿,1~2 ml/50 mm 培养皿,或2~4ml/ 100 mm 培养皿。 对于非贴壁细胞: ...
查看详情1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组DNA,用小量法(5 ml 培养物)或用CsCl/溴化乙锭离心法纯化重组DNA。 2. 将在DMEM-10 CS中生长汇片的COS-7细胞(每100 mm 培养皿约细胞)在转染的前一天以1:5的比例分瓶,这样第二天细胞将长至约50%汇片的程度,让细胞在 CO 2 培养箱中于37℃生长过夜至约50%汇片。 3...
查看详情在本实验中,已经介绍了将荧光素标记的Annexin-V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 ...
查看详情根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 一、光学显微镜和倒置显微镜 1. 未染色细胞 凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 2. 染色细胞 常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋...
查看详情Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用, 其中caspase-3 为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3 由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3 的活性明显下降。 一、Weste...
查看详情细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp 长的DNA 大片段, 或180~200 bp 整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA 后,用32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA ...
查看详情线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA 断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt 崩溃,则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6 ( 3 ) ] ...
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